Summary
Dermatitis herpetiformis (DH) er en kronisk inflammatorisk tilstand karakterisert ved en autoimmun reaksjon mellom IgA og epidermal transglutaminase (etg.). DH utvikler seg i en svært liten del av gluten-sensitive og / eller cøliaki pasienter. Resultatene av denne studien indikerer at DH kan også utvikle seg i en Rhesus ape vert med symptomer på idiopatic dermatitt.
Abstract
Tissue transglutaminase 2 (tTG2) er en intestinal fordøyelses enzym som deamidates allerede delvis fordøyd kosten gluten f.eks gliadin peptider. Hos genetisk disponerte individer, utløser tTG2 autoimmune reaksjoner som er karakterisert ved produksjon av tTG2 antistoffer og deres direkte avsetning i små tarmveggen 1,2. Tilstedeværelse av slike antistoffer utgjør en av de viktigste kjennetegnene på cøliaki (CD). Epidermal transglutaminase (etg.) er et annet medlem av transglutaminase familien som også kan fungere som en autoantigen i et lite mindretall av CD pasientene. I disse relativt sjeldne tilfeller utløser etg. en autoimmun reaksjon (hudutslett) klinisk kjent som dermatitis herpetiformis (DH). Selv om den eksakte mekanismen for CD og DH patogenese ikke er godt forstått, er det kjent at tTG2 og etg. dele antigene epitoper som kan bli gjenkjent av serum antistoffer fra både CD og DH pasienter 3,4.
(Macaca mulatta) med dermatitt (Tabell 1, fig. 1 og 2) ble brukt til å studere de berørte vev. I ett dyr (EM96) en spektral overlapping av IgA og tTG2 antistoffer (Fig. 3) ble demonstrert. Tilstedeværelsen av dobbel-positive tTG2 + IgA + celler var fokusert i den dype epidermis, rundt dermal papillae. Dette er konsistent med lesjoner beskrevet i DH pasienter 3. Da EM96 var plassert på en glutenfri diett, dermatitt, samt tTG2 + IgA + innskudd forsvant og var ikke lenger synlig (figur 1-3). Dermatitt dukket imidlertid basert på re-introduksjon av kosttilskudd gluten i EM96 (ikke vist). I andre makaker inklusive dyr med urelaterte dermatitt, ble tTG2 + IgA + innskudd ikke er oppdaget. Glutenfri diett-avhengig syndenes dermatitt i EM96 sammen med tilstedeværelse av tTG2 + IgA + celler i huden sin foreslå en autoimmun, DH-lignendemekanisme for utvikling av denne tilstanden. Dette er den første rapporten om DH-aktig dermatitt i enhver ikke-menneskelige primater.
Protocol
1. Hudbiopsi prøvetaking
- Før hudbiopsi prosedyre, anesthetize dyr intramuskulært med 2,5 mg / kg av tiletamine hydroklorid og zolazepam hydroklorid telazol blanding (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Overvåk dyrene fra administrasjon av anestesi inntil recumbency og deretter fjerne fra kabinettet sitt.
- Fjern hår fra huden området av interesse å utnytte en Oster gylne A5 Enkelt Speed Veterinary Clipper med en størrelse 40 blad (Oster Professional Products, McMinnville, TN) og aseptisk forberede med vekslende betadine skrubb og alkohol. Sikre en steril fenestrated drapere over den valgte biopsi nettstedet.
- Ved hjelp av en steril teknikk, plassere en 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biopsi instrument (Miltex, York, PA) mot huden mens du roterer instrumentet 180 grader med klokken og mot klokken med lett trykk til biopsi punsj transektene gjennom dermal lagene i subkutane TIssue. Fjern biopsi prøven og gripe transected delen av huden med pinsett og fri fra det subkutane vevet.
- Lukk huden defekten med 3-0 nylon sutur festet til en 3 / 8 sirkel kutte p (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, Storbritannia) i en cruciate mønster. Gi alle dyr 0,01 mg / kg buprenorfin hydroklorid (Hospira, Lake Forest, IL) intramuskulært for postoperativ smertelindring.
2. Prøvebehandling
- Arbeid med hudbiopsi prøver fra kronisk eksem og friske kontrollpersoner makaker rhesus. Få to til tre (4 mm i diameter) biopsi prøver fra hvert dyr.
- Fix første prøven i sink formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) i 24 timer, vask i vann i 30 min, vaske kort i 70% etanol, og legg inn ASP300 Leica vev prosessor (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS) der vev er dehydrert med stigende karakterer på 70%, 80%, 95% og 100% etanol 48min hver (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), etterfulgt av to endringer av xylen (Fisher).
- Bygg inn i parafin media (Fisher) for langtidslagring ved romtemperatur. Plasser ved-20oC i 20 min før snitting. Forbered seks mikrometer seksjoner ved hjelp av en rotasjonsmikrotom (HM325, Microm International, Waldorf, Tyskland). Plasser seksjoner på belastes lysbilder (Fisher) og lufttørke på 60oC natten. Flekken med hematoxylin og eosin (H & E) standard metode (beskrevet nedenfor).
- Fix andre utvalget i 2% Paraformaldehyde (USB Corp, Cleveland, OH) for 30 min ved romtemperatur, vask tre ganger i fosfatbufret saltvann (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, California), sted i 30% sukrose (Fisher) for 4 timer, og bygge inn i oktober frysing medium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Hold på-80oC i 20 min før snitting. Forbered 15 mikrometer seksjoner med cryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. H & E flekker
- Deparaffinize embedded seksjoner gjennom tre endringer av xylener (Fisher) og rehydrere gjennom gradert ethanols: tre endringer på 100%, to endringer på 95%, en endring på 80% og destillert vann, 2 min hver.
- Flekken med hematoxylin (Richard-Allan Scientific, Kalamazoo, MI) for en min og følger med en kort vask i rennende vann fra springen.
- Counterstain med eosin (Sigma) for 6 min.
- Dehydrere stained vev gjennom 95% og absolutt etanol, to endringer i 2 min hver og deretter tydelig i tre endringer av xylener, 3 min hver.
- Mount coverglass bruker Cytoseal Mounting Medium (Richard-Allan Scientific) over H & E-farget vev seksjoner.
Fire. Histopatologiske evaluering
Inspiser H & E-farget biopsi hud seksjoner under et lysmikroskop med 4 - 40x forstørrelse og Leica mikroskop med en SPOT Insight digitalkamera (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).
5. Immunofluorescent StaiNing
- Arbeid med DEC-embedded hud seksjoner for immunofluorescent farging. Før farging, bløt i 20 min i PBS som inneholder 0,2% fiskeskinn gelatin (FSG, Sigma) med 0,1% Triton X-100 (Sigma) for å fjerne OCT og permeabilize vevet.
- Etter vask av lysbilder, inkuberes med 10% normal geit serum (NGS, Sigma), fortynnet i PBS-FSG for 1 time i romtemperatur, i en fuktet skyve kammer.
- For å visualisere avleiring av IgA og tTG2 antistoffer, inkuber lysbilder med anti-rhesus IgA og tTG2 primære antistoffer, fortynnet i 10% NGS-PBS-FSG for 1 time.
- Vask med PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) i 10 min, etterfulgt av PBS-FSG i 10 min.
- Inkuber med sekundær, isotype-spesifikke antistoffer merket med Alexa Fluor fluorokromkonjugerte 488 (grønn), 568 (rød) eller 633 (blå) (Molekylær Sonder-Invitrogen) ved 1:1,000 fortynning. Bruk ToPro-3 dye å visualisere kjerne-DNA. Bruk 10% NGS-PBS-FSG som et antistoff fortynner.
- Bruk anti-leskende løsning (Sigma) å montere flekkete vev seksjoner.
Seks. Confocal bildebehandling
Utfør avbildning med en Leica TCS SP2 HIFI confocal Laser Scanning Microscope (Leica, Wetzlar, Tyskland) er utstyrt med tre lasere (seks linjer for eksitasjon tilgjengelig): en argon-krypton laser ved 488 nm (grønt), en krypton laser på 568 nm ( rød) og en helium-neon laser på 633 nm (blått), som spenner fra det synlig for langt-røde siden av spekteret. Record differensial interferens kontrast (DIC) bilder for vurdering av ikke-merkede vev arkitektur.
7. Representant Resultater
Et eksempel på en positiv anerkjennelse av etg. både tTG2 og IgA-antistoffer er vist i fig. 3A. I samsvar med situasjonen i menneskelige pasienter og på grunn av mye lavere prevalens av DH-aktig dermatitt enn CD-lignende glutenintoleranse også i rhesus-aper, er det meste av huden biopsiprøver forventes å show den positive reaksjonen med tTG2 antistoffer men uten tilstedeværelse av tTG2 + IgA + dobbel positive celler (fig 4). Disse DH-urelaterte saker, herunder dermatitt tilfeller av mikrobiell opprinnelse, vil avdekke noen single-positive IgA + celler spredt under epitelet, men ikke spektral overlapping mellom tTG2 og IgA-merket markører (figur 3B og 4). Derfor er det viktig å opprettholde orden over foreslåtte testprosedyrer, som starter med klinisk undersøkelse (Fig. 1), etterfulgt av histopatologisk vurdering (Fig. 2) og bare hvis ingen andre, mer vanlige dermatitt-agens kan identifiseres, confocal mikroskopi undersøkelse av hud biopsier farget for tTG2 og IgA er berettiget. Kliniske og / eller histopatologisk evalueringer alene er ikke tilstrekkelig for positiv diagnose på denne tilstanden. I de tilfeller hvor dobbel-positive (tTG2 + IgA +) celler er identifisert rundt området dermal papiller kan DH-aktig dermatitt diagnose utstedes. I slike tilfeller tilbaketrekking av kosttilskudd glutenog administrasjon av glutenfri diett anbefales for å lindre eksem symptomer.
Figur 1. Lysken regionen EM96 macaque før (A) og etter (B) tilbaketrekking av kosttilskudd gluten i 5 uker. Gjeninnføring av kosten gluten sammenfalt med tilbakekomst av dermatitt (C).
Figur 2. HE farging av EM96 macaque hud biopsier innhentet før (A) og etter (B) tilbaketrekking av kosttilskudd gluten i 9 uker. A: Epitel er fortykket (7-15 lag av epitelceller) med en tykk overfladisk skorpe av hyperkeratotiske celler infiltrert med degenereres nøytrofile. Nøytrofile vises også inne i epitel og blandes med moderate antall lymfocytter, plasmaceller og histiocytter rundt øyets omgivelser i øvre dermis. B: Noen hyperkeratosis er fortsatt til stede, er epithelial tykkelse normalisert (4-7 lag) med minimal lymphoplasmacytic infiltrasjon i øvre dermis. C: Normal abdominal hud fra FR56 macaque, uten lymphoplasmacytic infiltrasjon, er inkludert for sammenlikning. Forstørrelse 20x.
Figur 3. Konfokalmikroskopi bilder av EM96 macaque hud biopsier innhentet før (A) og etter (B) tilbaketrekking av kosttilskudd gluten i 9 uker. A: IgA flekker (grønn), tTG2 (rød) og ToPro-3 kjerne-DNA markør (blå). Samlokalisering av IgA og tTG2 vises i gult rundt området dermal papilae. B: Hud prøve tatt etter 9 uker med glutenfri diett viser ingen IgA i epitelet mens noen subepithelial IgA er fortsatt til stede (grønn), tTG2 (rød) og ToPro-3 kjerne-DNA markør (blå).
Figur 4.
| Animal Tag | Kjønn [M / F] | Age [År] | Kliniske symptomer | Plasma tTG2 antistoffer | Diet [1,2] * |
| HJ71 | F | 1.3 | Sunn | - | 1 |
| HD13 | M | 1.4 | Sunn, sporadisk diaré | + | 1 |
| FR56 | M | 5.4 | Kronisk idiopatisk diaré | - | 1 |
| EM96 | F | 5.0 | Kronisk eksem | + / - (Borderline) | 1 og 2 |
| GI24 | F | 4.6 | Kronisk eksem | - | 1 |
Tabell 1. TNPRC rhesus-aper som brukes til innsamling av hud biopsier
* Diet 1 - regelmessige apekatt chow (gluten-holdig), Diet 2 - glutenfri diett
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vårt nyetablerte ikke-menneskelige primater modell av glutenintoleranse ble nylig brukt til å studere intestinal permeabilitet endringer utløst av kosten gluten 5,6. Plasma tTG2 antistoffer samt intestinal tTG2 + IgA + innskudd ble oppdaget i noen gluten-sensitive makaker. Siden vi nylig identifiserte sjeldne tilfeller av idiopatisk dermatitt i kolonien rhesus-aper, der ingen vanlige (infeksiøs / metabolsk) etiologien kan være etablert, var formålet med denne studien er å vurdere om tTG2 + IgA + antistoff innskudd kunne påvises i huden prøver fra disse sjeldne tilfeller av dermatitt (Tabell 1).
Prevalens av tTG2 autoantistoffer som er en indikasjon på CD varierer mellom 1:70 og 1:200 7. Våre studier med gluten-sensitive makaker indikerer at utbredelsen av tTG2 antistoffer i fangenskap makaker rhesus minner om at rapportert fra menneskelige befolkning. Primær miljømessige og genetiske faktorer som kan være påvirket omfanget of slik utbredelse i både mennesker og aper er understudied 8,9. Faktorer som er assosiert med lavere forekomst av DH (1:400 til 1:10,000) enn CD er heller ikke kjent. Derfor er strengere forskning for å studere CD og DH patogenesen. Denne rapporten er den første til å demonstrere eksistensen av DH-aktig dermatitt i ikke-menneskelige primater. Til tross for at utbredelsen av DH-aktig dermatitt ser ut til å være mye lavere enn utbredelsen av gluten-sensitive enteropati også i makaker, presenterte resultatene gir håp for fremtidig forskning, forutsatt at flere dyr med DH-aktig dermatitt vil bli identifisert. Påvisning av dobbel-positive tTG2 + IgA + celler i huden biopsi av berørte dyr ved konfokalmikroskopi skal være instrumental i dette arbeidet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad, Stephanie feely, Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Pete Didier og Dorothy Kuebler for deres tekniske assistanse. Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend R01-DK076653 og 3R01-DK076653-02S1 til KS og basen driftsstøtte av TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
