Summary
Dermatitis herpetiformis (DH) er en kronisk inflammatorisk tilstand karakteriseret ved en autoimmun reaktion mellem IgA og epidermal transglutaminase (ETG). DH udvikler sig i en meget lille del af gluten-følsomme og / eller cøliaki patienter. Resultaterne af denne undersøgelse tyder på, at DH også kan udvikle sig i en rhesus abe vært med symptomer på idiopatisk dermatitis.
Abstract
Tissue transglutaminase 2 (tTG2) er en tarm fordøjelsesfremmende enzym, der deamidates allerede er delvist fordøjes kosten gluten f.eks gliadin peptider. I genetisk disponerede individer, udløser tTG2 autoimmune reaktioner, som er karakteriseret ved produktionen af tTG2 antistoffer og deres direkte deposition i tyndtarmens væg 1,2. Tilstedeværelsen af sådanne antistoffer er en af de vigtigste kendetegn for cøliaki (CD). Epidermal transglutaminase (ETG) er et andet medlem af transglutaminase familie, der også kan fungere som en autoantigen i en lille minoritet af CD patienterne. I disse relativt sjældne tilfælde, udløser ETG en autoimmun reaktion (hududslæt) er klinisk kendt som dermatitis herpetiformis (DH). Selvom den nøjagtige mekanisme af CD og DH patogenese ikke er godt forstået, er det kendt, at tTG2 og ETG aksjer antigene epitoper, der kan genkendes af serum antistoffer fra både CD og DH patienter 3,4.
(Macaca mulatta) med dermatitis (Tabel 1, Fig. 1 og 2) blev brugt til at studere de ramte væv. I et dyr (EM96) en spektral overlapning af IgA og tTG2 antistoffer (Fig. 3) blev demonstreret. Tilstedeværelsen af dobbelt-positive tTG2 + IgA + celler blev fokuseret i den dybe overhuden, omkring den dermale papiller. Dette er i overensstemmelse med læsioner, der er beskrevet i DH patienter på 3. Da EM96 blev placeret på en glutenfri kost, dermatitis, samt tTG2 + IgA + indskud forsvandt og blev ikke længere kan opfattes (fig. 1-3). Dermatitis genopstod dog baseret på genindførelse af kosten gluten i EM96 (ikke vist). I andre makakaber herunder dyr med uafhængige dermatitis, blev de tTG2 + IgA + indskud ikke fundet. Glutenfri kost-afhængige eftergivelse af dermatitis i EM96 sammen med tilstedeværelsen af tTG2 + IgA + celler i sin hud tyder på en autoimmun, DH-lignendemekanisme for udvikling af denne tilstand. Dette er den første rapport af DH-lignende dermatitis i enhver ikke-menneskelige primater.
Protocol
1. Hudbiopsi prøvetagning
- Forud for hudbiopsi procedure, bedøver dyr intramuskulært med 2,5 mg / kg af tiletamine hydrochlorid og zolazepam hydrochlorid telazol blanding (Fort Dodge Animal Health, Fort Dodge, IA). Overvåg dyr fra administration af bedøvelsesmiddel, indtil tilbagelænethed og derefter fjerne fra deres indhegning.
- Fjern hår fra huden interesseområde anvendelse af en Oster Golden A5 Single Speed Veterinary Clipper med en str. 40 klinge (Oster professionelle produkter, McMinnville, TN) og aseptisk forberede med skiftende betadine krat og alkohol. Sikre en steril fenestrated drapere over det valgte biopsi site.
- Ved hjælp af en steril teknik, placere en 4,0 mm Miltex Punch Dermal Biopsi instrument (Miltex, York, PA) mod huden, samtidig med at dreje instrumentet 180 grader med uret og mod uret med et let tryk, indtil biopsi Punch transekter gennem dermale lag i det subkutane TIssue. Fjern biopsi prøve og forstå transected del af huden med en pincet og fri fra det subkutane væv.
- Luk huden defekt med 3-0 nylon sutur fastgjort til en 3 / 8 cirkel skærende nål (Ethilon, Ethicon, Johnson & Johnson Medical Limited, Berkshire, England) i en cruciate mønster. Giv alle dyr 0,01 mg / kg buprenorphinhydrochlorid (Hospira, Lake Forest, IL) intramuskulært for postoperative analgesi.
2. Prøvebearbejdning
- Arbejde med hudbiopsi prøver fra kronisk dermatitis og raske kontrolpersoner rhesus makakaber. Anskaf 2-3 (4 mm i diameter) biopsi prøver fra hvert dyr.
- Fix første prøve i zink formalin (Z-fix, Anatech Ltd, Battle Creek, MI) i 24 timer, vask med vand i 30 min, vask kortvarigt i 70% ethanol, og anbringes i ASP300 Leica væv processor (Leica Microsystems Inc. , Buffalo Grove, KS), hvor væv er dehydreret med stigende grader af 70%, 80%, 95% og 100% ethanol 48min hver (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), efterfulgt af to ændringer af xylen (Fisher).
- Integrer i paraffin medier (Fisher) for langsigtet opbevaring ved stuetemperatur. Sted på-20oC i 20 minutter før udskæring. Gør 6 μm sektioner ved hjælp af en roterende microtome (HM325, microM International, Waldorf, Tyskland). Placer sektioner på ladede dias (Fisher) og luft tørre ved 60oC natten over. Pletten med hæmatoxylin og eosin (H & E) standard-metoden (beskrevet nedenfor).
- Fix anden prøve i 2% paraformaldehyd (USB Corp, Cleveland, OH) i 30 min ved stuetemperatur, vaskes tre gange i fosfatbufferet saltopløsning (PBS, Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA), som anbringes i 30% saccharose (Fisher) for 4 timer, og integrere i OLT-frysning medium (Sakura Finetek, Torrence, CA). Hold på-80oC i 20 minutter før udskæring. Forbered 15 μm sektioner ved hjælp af kryostat (HM560, Thermo Scientific, Kalamazoo, MI).
3. H & E farvning
- Deparaffinize embedDED sektioner gennem tre ændringer af xylener (Fisher) og rehydrere gennem sorteres ethanol: tre hold på 100%, to ændringer på 95%, en ændring på 80% og destilleret vand, 2 min hver.
- Pletten med hæmatoxylin (Richard-Allan Videnskabelige, Kalamazoo, MI) for en min, og følg en kort vaskes i rindende vand.
- Kontrastfarve med eosin (Sigma) i 6 min.
- Dehydrer farvede væv gennem 95% og absolut ethanol, to ændringer i 2 minutter hver og derefter fjerne i tre ændringer af xylener, 3 min hver.
- Mount dækglas ved hjælp Cytoseal Mounting Medium (Richard-Allan Scientific) over H & E-farvede vævssnit.
4. Histopatologiske evaluering
Efterse H & E-farvede biopsi hud sektioner under et lysmikroskop ved hjælp af 4 - 40x forstørrelse og Leica mikroskop med en SPOT Insight digitalt kamera (Digital Instruments Inc., Michigan, USA).
5. Immunofluorescent staiNing
- Arbejde med OLT-embedded hud sektioner for immunofluorescent farvning. Forud for farvning, blød i 20 minutter i PBS indeholdende 0,2% fiskeskind gelatine (FSG, Sigma) med 0,1% Triton X-100 (Sigma) for at fjerne OLT og at permeabilize vævet.
- Efter vask af dias, inkuberes med 10% normal ged serum (NGS, Sigma), fortyndet i PBS-FSG i 1 time ved stuetemperatur, i en fugtig slide kammer.
- For at visualisere aflejring af IgA og tTG2 antistoffer, inkuber objektglassene med anti-rhesus IgA og tTG2 primære antistoffer, fortyndet med 10% NGS-PBS-FSG i 1 time.
- Vask med PBS-FSG-Triton X-100 (Sigma) i 10 min, efterfulgt af PBS-FSG i 10 min.
- Inkuber med sekundær, isotype-specifikke antistoffer mærket med Alexa Fluor fluorokrom 488 (grøn), 568 (rød) eller 633 (blå) (Molecular Probes-Invitrogen) på 1:1,000 fortynding. Brug ToPro-3 farvestof til at visualisere det nukleare DNA. Brug 10% NGS-PBS-FSG som et antistof fortyndingsmiddel.
- Brug anti-afkølende løsning (Sigma) til at montere farvede vævssnit.
6. Konfokal billeddannelse
Udfør billeddannelse med en Leica TCS SP2 Ægte Konfokal Laser Scanning Microscope (Leica, Wetzlar, Tyskland) er udstyret med tre lasere (seks linjer for excitation tilgængelige): et argon-krypton laser ved 488 nm (grøn), en krypton laser på 568 nm ( rød) og en helium-neon laser på 633 nm (blå), der spænder fra det synlige til det yderste røde side af spektret. Optag forskellen interferens kontrast (DIC) billeder til vurdering af ikke-mærkede væv arkitektur.
7. Repræsentative resultater
Et eksempel på en positiv anerkendelse af ETG af både tTG2 og IgA antistoffer er vist i Fig. 3A. I overensstemmelse med situationen i mennesker og på grund af meget lavere forekomst af DH-lignende dermatitis end CD-lignende gluten følsomhed også i rhesus-makakaber, er de fleste af de hudbiopsi prøverne forventes at Show den positive reaktion med tTG2 antistoffer, men uden tilstedeværelse af tTG2 + IgA + dobbelt positive celler (Fig. 4). Disse DH-uafhængige sager, herunder dermatitis tilfælde af mikrobiel oprindelse, vil afsløre nogle enkelt-positive IgA + celler spredt under epitel, men ikke spektral overlapning mellem tTG2 og IgA-mærket markører (Fig. 3B og 4). Derfor er det vigtigt at fastholde den rækkefølge, foreslog testprocedurer, startende med klinisk undersøgelse (fig. 1), efterfulgt af histopatologiske evaluering (fig. 2), og kun hvis ingen andre, mere almindelige dermatitis-fremkaldende stoffer kan identificeres, konfokal mikroskopi undersøgelse af hud biopsier farvede for tTG2 og IgA er berettiget. Kliniske og / eller histopatologiske vurderinger alene er ikke tilstrækkeligt til positiv diagnose på denne tilstand. I de tilfælde, hvor dobbelt-positive (tTG2 + IgA +) celler er identificeret rundt om det område af dermal papiller, kan DH-lignende dermatitis diagnose blive udstedt. I sådanne tilfælde tilbagetrækning af kosten glutenog administration af glutenfri kost anbefales for at lindre dermatitis symptomerne.
Figur 1. Lyskelymfeknuder regionen EM96 makak før (A) og efter (B) tilbagetrækning af kosten gluten i 5 uger. Genindførelse af kosten gluten faldt sammen med genetablering af dermatitis (C).
Figur 2. HE farvning af EM96 makak hud biopsier er indsamlet før (A) og efter (B) tilbagetrækning af kosten gluten i 9 uger. A: epitel er fortykket (7-15 lag af epitelceller) med en tyk overfladiske skorpe af hyperkeratotiske celler infiltreret med udarter neutrofile. Neutrofiler synes også inde i epitel og blandes med moderate antal af lymfocytter, plasmaceller, og histiocytes omkring adnexa i den øvre dermis. B: Nogle hyperkeratosis er stadig til stede, epitelial tykkelse er normaliseret (4-7 lag) med minimal lymphoplasmacytic infiltration i den øvre dermis. C: Normal bughuden fra FR56 makak, uden lymphoplasmacytic infiltration, er medtaget til sammenligning. Forstørrelse 20x.
Figur 3. Konfokal mikroskopi billeder af EM96 makak hud biopsier er indsamlet før (A) og efter (B) tilbagetrækning af kosten gluten i 9 uger. A: IgA farvning (grøn), tTG2 (rød) og ToPro-3 nukleare DNA-markør (blå). Co-lokalisering af IgA og tTG2 vises i gult rundt om det område af dermal papilae. B: Skin udtaget efter 9 ugers glutenfri diæt viser ingen IgA i epitel, mens nogle subepithelial IgA er stadig til stede (grøn), tTG2 (rød) og ToPro-3 nukleare DNA-markør (blå).
Figur 4.
| Animal Tag | Sex [M / F] | Alder [År] | Kliniske symptomer | Plasma tTG2 antistoffer | Kost [1,2] * |
| HJ71 | F | 1,3 | Sund | - | 1 |
| HD13 | M | 1,4 | Sund, lejlighedsvis diarré | + | 1 |
| FR56 | M | 5,4 | Kronisk idiopatisk diarré | - | 1 |
| EM96 | F | 5,0 | Kronisk dermatitis | + / - (Borderline) | 1 og 2 |
| GI24 | F | 4,6 | Kronisk dermatitis | - | 1 |
Tabel 1. TNPRC rhesus makakaber, der anvendes til indsamling af hud biopsier
* Kost 1 - regelmæssig abe Chow (gluten-holdige) Kost 2 - glutenfri diæt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vores nyetablerede ikke-menneskelig primat model af gluten følsomhed blev for nylig anvendt til at studere den intestinale permeabilitet ændringer der udløses af kosten gluten 5,6. Plasma tTG2 antistoffer samt intestinal tTG2 + IgA + indskud blev påvist i nogle gluten-følsomme makakaber. Da vi for nylig identificeret sjældne tilfælde af idiopatisk dermatitis i koloni rhesus makakaber, hvor der ikke plejer (smitsom / metabolisk) ætiologi kunne etableres, Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om tTG2 + IgA + antistof indskud kunne påvises i hud prøver fra disse sjældne tilfælde af dermatitis (Tabel 1).
Udbredelsen af tTG2 autoantistoffer, der er tegn på CD svinger mellem 1:70 og 1:200 7. Vores studier med gluten-følsomme makakaber indikerer, at forekomsten af tTG2 antistoffer i fangenskab rhesus makakaber ligner rapporteret fra menneskelige befolkning. Primær miljømæssige og genetiske faktorer, som kan være påvirke omfanget of en sådan udbredelse i både mennesker og makakaber er understudied 8,9. Faktorer, der er forbundet med lavere forekomst af DH (1:400 til 1:10.000) end cd'en, er heller ikke kendt. Derfor er mere stringent forskning er nødvendig for at studere CD og DH patogenese. Denne rapport er den første til at påvise eksistensen af DH-lignende dermatitis i ikke-menneskelige primater. På trods af, at forekomsten af DH-lignende dermatitis synes at være meget lavere end forekomsten af gluten-følsomme enteropathy også i makakaber, præsenteret resultater giver håb for den fremtidige forskning, under forudsætning af, at yderligere dyr med DH-lignende dermatitis vil blive identificeret. Påvisning af dobbelt-positive tTG2 + IgA + celler i hud biopsier af syge dyr ved konfokal mikroskopi kan bidrage til sådanne bestræbelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Amanda Tardo, Dr. Mostafa Bouljihad, Stephanie Feely, Carol Coyne, Dr. Erin Ribka, Dr. Pete Didier og Dorothy Kuebler for deres tekniske assistance. Dette arbejde blev støttet af NIH giver R01-DK076653 og 3R01-DK076653-02S1 til KS og bunden driftstilskud af TNPRC RR000164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human IgA-FITC * | Sigma-Aldrich | F-5259 | 1:100 working dilution |
| Anti-Human tTG2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | MS-300-P1ABX | 1:100 working dilution |
| Anti-Mouse IgG1 ** | Invitrogen | A-21124 | 1:1,000 working dilution |
| ToPro-3 DNA probe *** | Invitrogen | T-3605 | 1:1,000 working dilution |
| Zinc Formalin (Z-fix) | Anatech Ltd., Battle Creek, MI | 171 | |
| OCT Freezing Medium | Sakura Finetek | 4583 | |
| Cytoseal Mounting Medium | Richard-Allan Scientific | 8312-4 | |
| Anti-Quenching Solution | Sigma-Aldrich | P 3130 | |
| Ethilon (Nylon Suture) | Ethicon Inc. | 663G | |
| Miltex Punch Dermal Biopsy Instrument | Miltex Inc. | NA | |
| Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with a size 40 blade | Oster Professional Products | 78005-050 | |
| Leica Tissue Processor | Leica Microsystems | ASP300 | |
| Rotary Microtome | Microm International | HM325 | |
| Cryostat | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HM560 | |
| Confocal Microscope | Leica, Wetzlar | TCS SP2 | |
| * Fluorescein isothiocyanate ** Secondary (Alexa Fluor 568-conjugated) antibody used after tTG2 primary antibody ** Dye |
|||
References
- Diosdado, B., Wijmenga, C. Molecular mechanisms of the adaptive, innate and regulatory immune responses in the intestinal mucosa of celiac disease patients. Expert. Rev. Mol. Diagn. 5 (5), 681-700 (2005).
- Schuppan, D., Dennis, M. D., Kelly, C. P. Celiac disease: epidemiology, pathogenesis, diagnosis, and nutritional management. Nutr. Clin. Care. 8 (2), 54-69 (2005).
- Sardy, M. Epidermal transglutaminase (TGase 3) is the autoantigen of dermatitis herpetiformis. J. Exp. Med. 195 (6), 747-757 (2002).
- Rose, C. Autoantibodies against epidermal transglutaminase are a sensitive diagnostic marker in patients with dermatitis herpetiformis on a normal or gluten-free diet. J. Am. Acad. Dermatol. 61 (1), 39-43 (2009).
- Bethune, M. Transepithelial transport and enzymatic detoxification of gluten in gluten-sensitive rhesus macaques. PLoS ONE. 3 (3), e1857-e1857 (2008).
- Mazumdar, K. Visualization of transepithelial passage of the immunogenic 33-residue peptide from α-2 gliadin in gluten-sensitive macaques. PLoS ONE. 5 (4), e10228-e10228 (2010).
- Schuppan, D., Junker, Y., Barisani, D. Celiac disease: from pathogenesis to novel therapies. Gastroenterol. 137 (6), 1912-1933 (2009).
- Hunt, K. Newly identified genetic risk variants for celiac disease related to the immune response. Nature Genet. 40 (4), 395-402 (2008).
- Abadie, V. Integration of genetic and immunological insights into a model of celiac disease pathogenesis. Annu. Rev. Immunol. 29, 493-525 (2011).
