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Biology

T CD4 + des lymphocytes capturer en utilisant une puce jetable microfluidiques pour le VIH

doi: 10.3791/315 Published: October 1, 2007

Summary

Protocol

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  1. Préparer canal microfluidique avec des anti-CD4 + de surface biotinlayted.
  2. Injecter 10 ml de l'échantillon sanguin à 5 ml / min dans le canal microfluidique avec pompe seringue.
  3. Rincer le sang à 20 ml / min pendant 20 min avec du PBS.
  4. Injecter une solution diluée d'FACS lyse (dilué à 10% de la solution stock avec PBS) à 5ul/min pendant 15 min.
  5. Incuber pendant 15 min.
  6. Injecter CD3 + solution d'anticorps primaire (dilué à 10% de solution stock avec du PBS) à 5 ml / min pendant 20 min.
  7. Incuber pendant 2 heures.
  8. Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
  9. Injecter 20% AF488 CD4 +, 0,2% d'une solution stock de DAPI, et 10% CD3 + anticorps secondaires à 5 ml / min pendant 20 min dans le même temps.
  10. Incuber pendant 20 min.
  11. Rincer le canal avec du PBS à 5 ml / min pendant 15 min.
  12. Comptez cellules sous microscope à fluorescence:
    1. Blanc (optique) - Noir et blanc: la cellule et de la poussière
    2. UV (DAPI) - Bleu: seule cellule
    3. Bleu (CD4 +) - Vert: des lymphocytes T et des monocytes
    4. Green (CD3 +) - Rouge: les lymphocytes T ne

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Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
PDMS microchannel Fabricated by SU-8 mold
Blood Donated blood from normal human subject. Mass General Hospital, 10 X high density WBC or Brigham and Women’s Hospital.
PBS Buffer Invitrogen 14190 1x Dulbecco’s Phosphated Buffered Saline.
FACS lysing solution BD Biosciences 349202 Diluted to 10% from stock solution with PBS.
Anti-CD4+ biotinlayted Ab Beckman Coulter Inc. IM0704 Surface prepared with Anti-CD4+ biotinlayted Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS/BSA after mixing with 0.2mg stock and 1ml deionized water.
goat anti-hCD3delta pAB Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-1128 Diluted to 10% from stock solution with PBS
rabbit anti-goat IgG PE Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-3755 Secondary Ab fro anti-CD3 Ab, diluted to 10% from stock solution with PBS
anti-human CD4+ BD Biosciences 557695 Alexa Fluor 488 labeled, diluted to 20% from stock solution with PBS.
DAPI Invitrogen D1306 4’,6-dianidino-2-phenylindole, dihydrochloride solution, diluted to 0.2% from stock solution with PBS.

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Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).More

Moon, S. J., Lin, R., Demirci, U. CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV. J. Vis. Exp. (8), e315, doi:10.3791/315 (2007).

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