Summary
Сравнительный подход видов позволяет поведенческих нейробиологов для изучения различных нейробиологических факторов, связанных с конкретными поведение рассматривается как характеристика конкретной модели животных. Воспользовавшись естественные различия в поведении между близкими видами, этот метод не требует инвазивных методов для манипулирования выражение поведения.
Abstract
Цель поведенческой неврологии является определение основных нейробиологических факторов, которые регулируют конкретные поведения. Использование животных моделей для достижения этой цели, многие методологические стратегии требуют инвазивных методов для управления интенсивностью поведение интерес (например, поражение методы фармакологической манипуляции, микродиализа техники, генной инженерии животных моделях). Использование сравнительного подхода видов позволяет исследователям, чтобы воспользоваться естественные различия в стратегии реагирования, существующих в близкородственных видов. В нашей лаборатории мы используем два вида рода Реготузсиз, отличающихся по отцовской ответов. Самец оленя Калифорнии мышь (Реготузсиз саШогшсиз) имеет тот же родительский ответов, как женщины в то время как его двоюродный брат, общие мышь оленя (Реготузсиз татсиШиз) имеет практически никакого воспитания / родительской реакции в присутствии щенков. Особый интерес в этой статье, изучение нейробиологических факторов, связанных с товарищеского социальные меры выставлены по отцовской мышь оленя Калифорнии. Потому что поведенческий подход неврологии многогранна, следующие ключевые компоненты исследования будут кратко рассмотрены: определение соответствующих видов для этого вида исследований, сбора данных для поведенческого анализа, подготовки и срезов мозга, основные этапы иммуноцитохимии для количественная оценка вазопрессина-иммунореактивности; использование программного обеспечения нейровизуализации количественно мозговой ткани; использование микросеквенирования видеоанализа забить поведение и, наконец, соответствующий статистический анализ, чтобы обеспечить наиболее сообщил интерпретации результатов исследований.
Protocol
1. Идентификация животных Модель
- Мышь Калифорнии Олень (Реготузсиз саШогшсиз) является идеальной моделью для изучения отцовской ответов. Как видите, эта мышь женихов щенков так же, как мамы делают - они даже присесть на них, чтобы он выглядел, как щенки кормления. Поведение Калифорнии мышей по сравнению с видами того же рода, общие мышь оленя (Реготузсиз татсиШиз), который экспонатов мало интереса к щенкам, часто при попытке к бегству или даже напасть на них. (См. рисунок 1 для картин из этих видов, взаимодействующих с щенками.)
- Как только вид модели был определен тогда различные группы должны быть созданы. В этом исследовании биологических отцов, девы, без родительского опыта и девиц с ограниченными щенка экспозиции (щенок, подвергшихся воздействию или приемных отцов) обоих видов используется так, чтобы обе предрасположены и приобретенными отцовской характеристики могут быть оценены. В данном исследовании мы также подвержены все группы игрушка мышь щенка заверить, что социальные взаимодействия являются специфическими для щенка, а не представитель ответ на что-либо помещены в клетку (см. рисунок 2).
- Прежде чем исследовать нейробиологических факторов, важно, чтобы подтвердить, что отдельные виды выставку четкие различия в поведении интерес. В этом исследовании, самцы помещают в клетку с щенком в течение пяти минут и отцовской ethogram поведения (см. таблицу 1 для примера ethogram) используется для оценки поведения, таких как задержки подойти к щенку и количество времени, потраченное в контакте с щенка. Если к решительным мерам наблюдается, щенок немедленно удалены. Эти занятия часто видеозаписи так осторожны поведенческий анализ может быть проведен в дальнейшем.
2. Подготовка ткани мозга
- После стандартной перфузии каждой мыши (протокол прилагается), мозги будут удалены, так что они могут быть секционного в конкретной области интересов (показать мозга).
- Стандартный атлас мозга мыши (показать атлас) используется для обнаружения паравентрикулярное ядра в гипоталамусе, области, как известно, богата клеток, продуцирующих нейропептида интерес в данном исследовании - вазопрессин (AVP).
- Мозг затем блокируют и установлен на замораживание патрон так, чтобы ткань заморозят до того секционного с микротоме. Мозг подразделяется на отделку режиме, пока конкретные ориентиры определены, то определенной толщины мозга, 30 микрон в данном случае, имеет значение для мозга участков, которые используются для анализа.
- Мозг разделы осторожно помещают в хорошо пластинами заполнено фосфатного буфера физиологический раствор (PBS), (Протокол прилагается PBS, пожалуйста, обратите внимание, что это только один пример стандартного протокола иммуноцитохимии).
3. Иммуноцитохимическая
- На протяжении различных этапов этого процесса (см. прилагаемый протокол), важно иметь точную пипетирования навыки для обеспечения точных измерений химических веществ и других ингредиентов, важные для этой техники (пипетки показать студента).
- Первым шагом в этом процессе является мытье мозгов который включает в себя замену PBS в луночных три-пять раз, между каждой стирки луночных размещаются на рокера в течение 10 минут (показать студенту замене PBS и размещение также пластин на рокеров) .
- Мозг ломтиками, затем подвергается первичной решение антител и хранили при 4 ° С в течение ночи на рокера (показать процесс).
- После другого мыть, мозг ломтики подвергаются вторичными антителами в течение одного часа на рокера при комнатной температуре, затем снова промывают.
- Следующая мозги подвергаются Avitin-Биотин Комплексное решение для подготовки к визуализации нейрохимические-положительных клеток.
- За последний шаг визуализации, мозг подвергается DAB. Это опасный продукт и всегда должны быть обработаны с осторожностью. Как видно здесь, ломтики мозга начинают темнеть у вас на глазах (показать процесс).
- После экспозиции DAB, мозги пройти последнюю серию моет, а затем осторожно положил на subbed слайды микроскопом и дают высохнуть в течение ночи (показать размещение мозга срез на слайде, см. вложение для subbed протокол слайды).
- Слайды, затем очищен через серию дистиллированной моется водой и спиртом, наконец-то погружен в Citrosolv перед coverslipped и хранится в slidebox для безопасного хранения (показать различные аспекты этого процесса, см. вложение для процесса очистки).
4. Neuroquantification
- После слайды высохли, они могут быть оценены со специализированным программным обеспечением neuroquantification. Здесь Bioquant программное обеспечение используется для количественного вазопрессин-положительных клеток и волокон в перивентрикулярном ядре мозга мыши (показать программного обеспечения на экране ... и микроскопа).
- Конкретной области интересов определяется с помощью измерения вариантыпрограммного обеспечения для создания визуальных поле для neuroquantification. Важно, что соответствует визуальный размер поля количественно для каждого животного (показать студент делает это).
- Здесь темно окрашенные вазопрессин-иммунореактивного тела клеток и волокон являются очевидными. Потому что это трудно рассчитывать, или проследить эту ткань, особенностью этого программного обеспечения использует свет порога для определения общего количества положительно окрашенных тканей в пределах заданной области интереса. Этот порог говорит нам, сколько из указанной области, содержащиеся вазопрессин-положительных ткани (показать значение данных на экране компьютера).
5. Поведенческий анализ
- Если более чем один наблюдатель будет забил видеокассеты, важно установить между оценщик надежность заверить, что наблюдатели забив поведения в согласованном порядке. Для фактического сессии скоринг, скоринг лист поведения должны быть готовы позволяют легко забил поведения во время наблюдения сессий (см. Таблицу 2 для примера забил электронной таблицы).
- Для поведения, которые не быстрые эпизодические ответов, микросеквенирования анализ может показать, тонкости о прогрессировании конкретные ответы. Например, уход поведения состоит из цепочки очень быстрые ответы. Хотя одним из вариантов является просто зафиксировать наличие и продолжительность груминга, другой для документирования цепи событий, сопровождающих этот ответ. С помощью этого программного обеспечения микросеквенирования, наблюдатели оценка наличия определенного поведения каждого второго, а вызвана программным обеспечением (ПО-шоу и видео).
- После сбора данных, параметров, представляющих интерес, определены и соответствующие поведенческие оценки анализируются. Примерами могут быть общая продолжительность времени, проведенного в контакт с щенком, или количество сбоев в уходе последовательности (показать компьютер с электронной таблицы с данными введены для каждого животного).
- Как только поведение забил важно, чтобы подтвердить, что два вида выставлены различные стратегии реагирования на поведение интерес в исследовании. В этом случае мышей Калифорнии олени должны проявлять больше отцовского поведения, чем общие мышей оленей. Кроме того, различные поведенческие меры могут быть связаны с мозгом меры, чтобы получить более обоснованные зрения соответствующих воздействий.
6. Представитель Результаты:
- Для проверки модели, данные должны четко указать, что два вида, осуществляется по-разному в отношении поведения, представляющих интерес. Здесь вы видите, что П. саШогшсиз мужчины проводили больше времени холить и согнувшись над щенков, два клейма отцовской ответов (см. рисунок 4).
- Для того, чтобы определить, является ли переменная neurobiologial интереса играет важную роль в отцовской ответов, количество вазопрессина (АВП)-положительные ткани количественно в течение нескольких соответствующих областях мозга, как видно, отцовское П. саШогшсиз животные более устойчивы-положительных ткани в некоторых из этих областей мозга. (См. Рисунок 5).
- В связи с этим исследование с использованием микросеквенирования анализа было предположить, что отцовская мышей Калифорнии будет проявлять меньше беспокойства, чем их коллеги девственница, соответственно, при контакте с хищником запах, отцы выставлены меньше перерывов в уходе последовательности, чем животные девственница (см. рис 6).
Рисунок 1: (А) у мышей-самцов Калифорнии выставке отцовской ответы к конспецифичный чужой щенок. (B) Мужской мышь оленя выставке осторожного подхода (стрейч участие) и избегание ответа в присутствии конспецифичный чужой щенок. Примечание: В этих оценок социального взаимодействия, если мужчина экспонатами к решительным мерам по отношению к щенку, экспериментаторы сразу же попал в верхней части клетки, чтобы отвлечь мужчину. В это время сессия завершается, и щенок удаляется, проверяется на наличие раны и вернулся к матери. В нашей лаборатории, это редко наблюдается с П. саШогшсиз мужчин, но иногда наблюдается с П. татсиШиз; пристального наблюдения и немедленного вмешательства, однако, предотвращения вреда от происходящих с животными.
Рисунок 2: мышь Калифорнии взаимодействия с мышью игрушкой, большинство пытались жевать эти раздражители.
Рисунок 3: Экспериментальная дизайн исследования; насчитывалось около 6 животных в каждой группе для каждого вида.
Рисунок 4: Графический иммуноцитохимического процесса.
ИнжирЮр 5 Отцовский ответы в Калифорнии и оленей мышей;. отцовской больше ответов (жених, приседать, быстрее подход) наблюдались у мышей Калифорнии. Более растянуть присутствовал (стресса) наблюдались в оленьих мышей.
Рисунок 6. Вазопрессин иммунореактивности в различных областях мозга обоих видов. Калифорния мышей было больше окрашивания в PVN клеток и волокон.
Рисунок 7: Отцовский мышей Калифорнии выставлены меньше сбоев в их ухода последовательностей в присутствии хищника запах, чем щенок, подвергшихся воздействию и девственной групп.
Discussion
В данной статье рассматриваются три основных компонента считается критическим для успешного выполнения поведенческих исследований неврологии: (1) представительных и действительны животной модели, (2) точные и чувствительные иммуноцитохимии протокола; и (3) наиболее анализа (наблюдений и статистических ) как поведенческие и мозг данных. Ошибки в одну категорию наверняка компромисс результаты всего исследования. Таким образом, после тщательного выбора подходящей модели животных, значительные усилия должны быть направлены на экспериментальное тестирование поведенческих и гистологических процедур заверить, что поведение будет надежно наблюдается в исследовании, за успешную обработку мозгов.
Как упоминалось ранее, использования сравнительных видов для выявления нейробиологических механизмов тот или иной ответ является ценным методологическим подходом, потому что это решение не требует генной инженерии или болезненных хирургических манипуляций. Таким образом, этот методологический подход использует меньшую угрозу, интактных животных. Использование природных вариаций животных, однако, усиливается объединению природных подобных средах, даже если животные размещены в лаборатории. Далее, если лабораторные исследования можно распространить на поле для дальнейшей проверки подлинности видовые различия в поведении интерес, это следующий шаг рекомендуется. Хотя сравнительный подход имеет много преимуществ, ограничение корреляционного характер данных, и, следовательно, дополнительные методы, такие как фармакологические манипуляции должны быть использованы для дальнейшей проверки роль целевых нейробиологических систем в поведении интерес.
Как только экспериментаторы уверены, о поведенческих, гистологических и статистических процедур, следует позаботиться, чтобы условия жизни животных остаются неизменными для всех групп, кроме, конечно, для экспериментальных манипуляций. Изменения в переменных, таких как свет, графика, уровни шума, смотрители, уровень влажности и запахов в лаборатории может оказать существенное воздействие на нейробиологические ответы животных.
В этой статье первичных антител был использован для обнаружения вазопрессина, но и других первичных антител может быть использован для множества различных нейрохимических веществ, представляющих интерес. Если экспериментатор работает с новых антител, важно проводить титрование исследований для определения оптимального разведения новых антител. Много раз слишком много антител используется (как это было предложено поставщика), в результате чего ткани, которая слишком темно, чтобы различать сигнал, более того, чрезмерное использование антител, стоит очень дорого.
Наконец, если более одного статистического анализа могут быть использованы для предоставления альтернативных взглядов и интерпретаций данных, они должны быть использованы. В данном конкретном исследовании, общие модели линейного, корреляционного и многомерного анализа масштабирования были использованы для предоставления наиболее информативными видами данных.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было профинансировано грантом нет. 0723341 (для КГЛ) из Национального научного фонда. Мы также благодарны за поддержку, оказываемую Шапиро Бакалавриат Программа стипендий исследований и факультета психологии в Рэндольф-Макон колледже. Наконец, мы ценим Крейг Кинсли в совместной вклад в это исследование и помочь Аманда Rzucidlo в подготовке R-MC лаборатории для этого видео статьи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
