Summary
比較種のアプローチは、行動の神経科学者は、特定の動物モデルの特性として表示、特定の動作に関連するさまざまな神経生物学的要因を探索することができます。自然に近縁種との間の動作の違いを発生を生かし、この手法は侵襲的手法は行動の発現を操作する必要はありません。
Protocol
1。動物モデルの同定
- カリフォルニア州の鹿マウス（Peromyscusカブリダニは ）父親の反応を探索するのに理想的なモデルです。ご覧のようにお母さんと同じように、このマウスは、子犬をグルーミング - 彼らも、子犬が授乳のようにそれが見えるようにそれらの上にしゃがま。カリフォルニアのマウスの動作は同じ属に、多くの場合、エスケープするかも、それらを攻撃しようとして、子犬にはほとんど関心を示す一般的なシカのマウス（Peromyscus maniculatus）の種と比較されます。 （子犬との相互作用これらの種の写真を図1を参照してください。）
- 種のモデルが特定されたらその後さまざまなグループを確立する必要があります。本研究では、生物学的な父親、ない子育ての経験を持つ処女、および両種の限られた子犬露出（PUP -露出またはフォスター父親）との処女がかかりやすいと買収の両方父方の特性を評価できるようにするために使用されます。この特定の研究で我々はまた、社会的相互作用は、ケージに入れ、何にでも子犬としない代表的な応答に特異的であることを保証するために子犬のおもちゃのマウスへのすべてのグループを露出し（図2を参照してください。）
- 神経生物学的要因を調査する前に、それは選択された種は、関心の動作の明確な違いを示すことを確認することが重要です。本研究では、男性は5分と父性行動のエソグラムのための子犬をケージに入れている（エソグラムの例については、表1を参照）と接触して過ごした子犬と時間の量に近づくために待ち時間などの行動を獲得するために使用されます子犬。積極的な反応が認められた場合には、子犬はすぐに削除されます。慎重な行動分析が続いて実施できるよう、これらのセッションは多くの場合、ビデオテープに録画されています。
2。脳組織の準備
- 各マウスの標準灌流（添付のプロトコル）に続いて、脳はそれらが関心の特定の領域（ショー脳）に区分することができるように削除されます。
- バソプレシン（AVP） - 標準的なマウスの脳アトラス（地図アトラス）は視床下部の室傍核、本研究への関心の神経ペプチドを産生する細胞が豊富であることが知られている領域を見つけるために使用されます。
- 組織はミクロトームで切片化される前にフリーズするように、脳は、ブロックし、凍結チャックに装着される。特定のランドマークが識別されるまで、脳がトリムモードに区分される、その後、特定の脳の厚さが、この場合は30ミクロンは、解析に用いる脳切片のために設定されています。
- 脳切片を慎重にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を充填したウェルプレートに配置され、（添付のPBSのためのプロトコルが、これは標準的な免疫プロトコールの一例であることに注意してください）。
3。免疫細胞化学
- このプロセスの様々な手順（添付のプロトコールを参照）を通して、それは化学物質と、このテクニックのための重要な他の成分の正確な測定を（学生のピペッティングを表示）確実に正確なピペッティングのスキルを持つことが重要です。
- このプロセスの最初のステップは、ウェルプレート3〜5倍にPBSを置換などの脳を洗浄され、各洗浄の間にウェルプレートを10分間ロッカーに置かれている（学生はPBSを交換し、ロッカーにウェルプレートを配置することを示す） 。
- 脳スライスは、一次抗体溶液に暴露し、ロッカー（ショープロセス）で℃で一晩4℃で保存されます。
- 別の洗浄に続いて、脳のスライスを再度洗浄し、室温でロッカーで1時間二次抗体にさらされている。
- 次に、脳を神経化学的陽性細胞の可視化のために準備するAvitin - ビオチン複合体溶液にさらされている。
- 最終的な可視化のステップでは、脳がDABにさらされている。これは危険な製品であり、常に注意して取り扱ってください。ここに見られるように、脳のスライスは、（プロセスを表示する）あなたの目の前で暗い取得し始める。
- DABの暴露後に、脳は洗浄の最後のシリーズを通過してから、慎重にsubbed顕微鏡スライド上に配置され、（スライド上に脳スライスの配置を示す。subbedスライドのプロトコルのための添付ファイルを参照してください）一晩乾燥させる。
- スライドはその後、最終的に（;プロセスをクリアするための添付ファイルを参照してこのプロセスの様々な側面を見せる）封入し、安全のためslideboxに格納される前にCitrosolvで水没、蒸留水とアルコールの一連の洗浄によってクリアされます。
4。 Neuroquantification
- スライドが乾燥した後、彼らは専門のneuroquantificationソフトウェアを使用して評価することができます。ここでBioquantソフトウェアは、マウスの脳の室傍核（画面上のソフトウェア...と顕微鏡を示す）でバソプレッシン陽性細胞と繊維を定量化するために使用されます。
- 興味のある特定の領域は、測定オプションを使用して識別されますneuroquantificationための視野を確立するためのソフトウェア。一貫性のある視野の大きさが（ショーの学生がこれを行う）、各動物のために定量化されていることが重要です。
- ここで黒く染まったバソプレッシン免疫反応性細胞体と繊維が明らかである。それはこの組織をカウントまたはトレースすることは困難であるため、このソフトウェアの特徴は、興味の指定した領域内に陽性染色組織の総量を決定するために、光スレッシュホールドを使用しています。この閾値はバソプレッシン陽性組織を（コンピュータの画面上にデータ値を表示する）に含まれるどれだけ、指定された領域のを教えてくれる。
5。行動解析
- 複数の観察者がビデオテープをスコアリングする場合、それは観察者が一貫した方法で動作を獲得していることを保証するために評価者間信頼性を確立することが重要です。実際のスコアリングセッションの場合、行動スコアリングシート（スプレッドシートの得点の例については表2を参照）の観測セッション中の動作の簡単なスコアリングを可能にするために準備する必要があります。
- 高速エピソード応答ではない行動のために、ミクロの分析は、特定の反応の進行についての微妙な違いを明らかにすることができます。例えば、行動をグルーミングすることは非常に速い応答のチェーンで構成されています。ひとつのオプションは、単にグルーミングの存在と持続時間を記録することですが、もう一つはこの応答を伴う一連の出来事を文書化することです。このミクロソフトウェアを使用して、オブザーバーは、ソフト（番組ソフトおよびビデオ）の指示に従って、毎秒特定の行動の存在を得点する。
- データの収集に続いて、関心のパラメータが決定され、適切な行動スコアが分析されます。例としては、グルーミング、シーケンスの中断（各動物のために入力したデータとスプレッドシートを使用してコンピュータを表示する）の子犬、または番号との接触に費やす時間の合計時間があります。
- 行動が得点されると、それは2つの種が研究への関心の振る舞いに対して異なる応答戦略を示したことを確認することが重要です。この場合、カリフォルニア州の鹿のマウスは、一般的なシカのマウスよりも父性行動を示すべきである。さらに、様々な行動措置は、関連する影響のより多くの情報ビューを取得するために、脳の対策と相関することができます。
6。代表的な結果：
- モデルを検証するために、データは明らかに2つの種が関心の動作に関して異なる方法で実行することを示す必要があります。ここでは、そのP.を参照してください。 カブリダニの男性は（図4を参照）、父親の反応の二つの特徴をグルーミングし、子犬を介してしゃがんで多くの時間を過ごした。
- 見られるように、父方のP.;関心のneurobiologial変数は、父方の応答に重要であるバソプレッシンの量（AVP）陽性組織が いくつかの関連する脳の領域のために定量化されているかどうかを判断するために、 カブリダニの動物は、これらの脳領域のいくつかのより多くの免疫陽性細胞を持っていた。 （図5を参照）。
- ミクロ分析を使用して関連する研究では、それは父方のカリフォルニアのマウスは、その処女の対応よりも不安を示すという仮説された;それに応じて、捕食者の匂いにさらされると、父親は（図を参照してバージンの動物よりも身づくろい順序で中断が少なくて展示6）。
図1：子犬同種異星人に向かって父方の応答を示す（A）オスカリフォルニアマウス。子犬同種のエイリアンの存在下で慎重なアプローチ（ストレッチが出席）と回避反応を示す（B）オス鹿のマウス。注：男性が子犬に向かって積極的な反応を示す場合は、これらの社会的相互作用の評価では、実験者はすぐに男性の気をそらすためにケージの上部にヒット。この時点でセッションは終了し、子犬は、削除された傷のために検査し、母親に返されます。当研究室では、このことはほとんどPで観察されない男性のカブリダニが時折Pで観測されるmaniculatus、近くに観察し、即時の介入は、しかし、動物への発生から被害を防ぐ。
図2：おもちゃのマウスとの対話カリフォルニアのマウスは、ほとんどのこれらの刺激にかむことを試みた。
図3：研究の実験設計、各種の各グループで約6匹の動物があった。
図4：免疫細胞化学プロセスのグラフィック。
図URE 5カリフォルニア州とシカのマウスの父親の応答;より多くの父方の応答は、（新郎、しゃがみ、より速くアプローチ）カリフォルニア州のマウスで観察された。より多くのストレッチ通う（ストレス応答）が鹿のマウスで観察された。
図6。両種の様々な脳領域におけるバソプレッシンの免疫反応。カリフォルニアのマウスは、PVNの細胞や繊維のより多くの染色を持っていた。
図7：父親のカリフォルニアのマウスは、子犬に暴露し、バージングループよりも捕食者の匂いの存在下で彼らの身づくろいのシーケンスに少ない混乱を示した。
Discussion
（2）正確で高感度免疫細胞のプロトコル、および（3）ほとんどの分析（観測と統計的（1）代表者との有効な動物モデル：この記事では、3つの基本的なコンポーネントは、行動神経科学の調査の実行が成功するために重要であると考えられて説明します）行動と脳データの両方の。単一のカテゴリの間違いが最も確かに全体の研究の成果が損なわれます。したがって、慎重に適切な動物モデルを選択した後、かなりの努力が脳の正常な処理に続いて、動作が確実に試験で観察されることを保証するために行動し、組織学的手順をテストするパイロットの方に指示されるべきである。
前に述べたように、このテクニックは、遺伝子工学や痛みを伴う手術操作を必要としないため、特定の応答の神経生物学的メカニズムを識別するための比較種の使用は、貴重な方法論的アプローチです。従って、この方法論的アプローチは少ない絶滅、インタクトな動物を利用しています。動物の自然なバリエーションの使用は、しかし、動物を実験室に収容されている場合でも、自然に似た環境の取り込みによって強化されている。実験室での研究がさらに関心の挙動に種差の真正性を検証するためにフィールドに拡張することができれば更に、、この次のステップをお勧めします。比較アプローチは多くの利点を提供するが、制限は、データの相関性質であり、したがって、そのような薬理学的操作などの追加のテクニックは、さらに関心の動作で標的神経生物学的システムの役割を検証するために使用する必要があります。
実験者は、行動学的および統計的な手続きについての自信と、ケアは、動物の生活条件は、実験的な操作のため、もちろん、以外のすべてのグループに対して一定に保てるように注意してください。このような実験室での光のスケジュール、ノイズレベル、世話人、湿度や臭いなどの変数の変化は、動物の神経生物学的反応に大きな影響を及ぼす可能性があります。
この記事では一次抗体は、バソプレシンの検出に使用されていましたが、他の一次抗体は、関心の異なる神経化学物質の過多に使用することができます。実験者は、新しい抗体を用いて動作している場合、それは新しい抗体の最適希釈率を決定するために滴定の研究を実施することが重要です。さらに、抗体の過剰な使用は非常に高価であり、多くの時間が多すぎる抗体は、信号を区別するために、暗すぎる組織で、その結果、（のようなベンダーによって提案された）が使用されます。
単一の統計分析よりも、代替ビューとデータの解釈を提供するために使用することができれば最後に、、それらを利用すべきである。この特定の研究では、一般線形モデル、相関、および多次元尺度分析は、データの最も有益なビューを提供するために使用された。
Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、助成金なしで賄われていた。全米科学財団から0723341（KGLまで）。我々はまた、シャピロ学部研究フェローシッププログラムとランドルフ - メイコン大学で心理学科が提供するの貢献に感謝しています。最後に、我々はこの研究ではクレイグマラキンスリーの共同の貢献に感謝し、このビデオの記事のためにR - MCの実験室を準備するのアマンダRzucidloのヘルプを参照してください。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
