Summary
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة من الناحية الفسيولوجية. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، المشبك التسجيلات جنبا إلى جنب مع التحليل الضوئي في مخيم في قفص أو قفص كاليفورنيا لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية.
Abstract
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يسمح للإنتاج زيادات سريعة ومحلية في مختلف تركيز المركبات النشطة فسيولوجيا 1. المركبات التي هي عبارة عن جزيئات في قفص خاملة من الناحية الفسيولوجية عن طريق قفص الكيميائية التي يمكن كسرها ومضة من الضوء فوق البنفسجي. هنا ، وتبين لنا كيفية الحصول على التصحيح ، جنبا إلى جنب مع تسجيلات المشبك التحلل الضوئي للمركبات في قفص لدراسة تنبيغ الشمية في الخلايا العصبية الشمية فصل الماوس الحسية. عملية تنبيغ الشم (الشكل 1) يحدث في الخلايا العصبية الحسية الأهداب الشمية ، حيث ملزم لمستقبلات الرائحة يؤدي إلى زيادة في مخيم الذي يفتح بوابات دوري النوكليوتيدات (CNG) قنوات 2. كاليفورنيا الدخول من خلال القنوات CNG تنشيط قنوات الكالسيوم تنشيط الكلورين. نعرض كيفية فصل الخلايا العصبية من الماوس ظهارة شمية (3) وكيفية تفعيل قنوات الغاز الطبيعي المضغوط أو تنشيط قنوات الكالسيوم الكلور بواسطة التحلل الضوئي في مخيم قفص 4 أو 5 في قفص كا </ سوب>. نستخدم مصباح فلاش 6،7 لتطبيق ومضات الأشعة فوق البنفسجية إلى المنطقة الهدبية إلى مخيم uncage أو الكالسيوم في حين تؤخذ التصحيح ، المشبك تسجيلات لقياس التيار في تكوين الجهد المشبك خلية كاملة 11/08.
Discussion
فلاش التحلل الضوئي للمركبات في قفص جنبا إلى جنب مع التصحيح ، المشبك التسجيلات هي تقنية مفيدة للحصول على القفزات السريعة والمحلية في تركيز الجزيئات النشطة من الناحية الفسيولوجية داخل وخارج الخلايا. وتم تصنيع عدة أنواع من compounds1 في قفص ، ويمكن تطبيق هذه التقنية لمختلف أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا المستزرعة معربا عن قنوات ايون التي يمكن تفعيلها عن طريق التضمين أو التحلل الضوئي لبعض المركبات المتوفرة في قفص 11.
التحلل الضوئي للمركبات في قفص يتطلب نبضات من كثافة عالية من الأشعة فوق البنفسجية قرب uncage على كمية كافية من الجزيئات في وقت قصير. ويمكن استخدام مصادر الضوء المختلفة : قوس الزئبق أو مصباح زينون تعمل باستمرار تسيطر عليها مصراع وبالإضافة إلى منفذ epifluorescent من المجهر ، وميض مصباح زينون ، ليزر الأشعة فوق البنفسجية ، والأشعة فوق البنفسجية وضعت مؤخرا الطاقة العالية ضوء ينبعث منها الصمام الثنائي (LED ). لكل نوع من مصدر الضوء لديها مزايا وdisadvanتاغس وفقا لتطبيق معين ، وإلى تكلفة الأجهزة. مقارنة مصباح فلاش ، مصابيح تعمل باستمرار يقل لديهم شدة الضوء ، وبالتالي فإن مدة نبضات الضوء يسيطر عليها مصراع يحتاج إلى زيادة تصل إلى عدة مئات من مللي ثانية للحصول على كمية كافية من جزيئات uncaged. ليزر الأشعة فوق البنفسجية هي مكلفة جدا. الأشعة فوق البنفسجية عالية الطاقة المصابيح 14 للتحلل الضوئي فلاش ومؤخرا المتاحة تجاريا ويمكن أن توفر بديلا جيدا لطرق أخرى. ومع ذلك ، ميزة الفلاش من المصابيح هو أن لديهم مجموعة أوسع من الانبعاثات المصابيح فوق البنفسجية ، مما يتيح استخدام أنواع عدة من المركبات في قفص مع الخصائص الطيفية المختلفة والمزايا الرئيسية لاستخدام مصباح فلاش زينون لuncaging في التطبيق لدينا هي : جيدة القرار الوقت ، بل ومدة النبضة الضوء حوالي 1 مللي ثانية ؛ طائفة واسعة فوق البنفسجية التي هي مناسبة للتحلل الضوئي من الجزيئات الضوئية مع خصائص مختلفة ، وإمكانية اختيار الدايمnsion من بقعة ضوء لإنارة المنطقة الهدبية ، وإمكانية لتحديد شدة الضوء المختلفة بسهولة 6. بالإضافة إلى ذلك ، مصباح فلاش Xenon وبتكلفة معقولة ، وتنفذ بسهولة في انشاء الكهربية ، ولا تتطلب صيانة خاصة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
