Summary
Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide cAMP of gekooid Ca voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen.
Abstract
Fotolyse van gekooide verbindingen maakt de productie van snelle en gelokaliseerde toename van de concentratie van diverse fysiologisch actieve verbindingen 1. Gekooide verbindingen zijn moleculen gemaakt fysiologisch inactief door een chemische kooi die kan worden doorbroken door een flits van ultraviolet licht. Hier laten we zien hoe de patch-clamp opnames gecombineerd met fotolyse van gekooide verbindingen voor de studie van olfactorische transductie in gedissocieerde muis olfactorische sensorische neuronen te verkrijgen. Het proces van olfactorische transductie (figuur 1) vindt plaats in de cilia van olfactorische sensorische neuronen, waar odorant binding aan receptoren leidt tot de toename van cAMP dat cyclische nucleotide-gated (CNG) kanaal 2 wordt geopend. Ca ingang door CNG kanalen activeert Ca-geactiveerde Cl kanalen. We laten zien hoe de neuronen distantiëren van de muis olfactorische epitheel 3 en hoe CNG kanalen of Ca-geactiveerde Cl-kanalen activeren door fotolyse van gekooide cAMP 4 of gekooid Ca 5 </ Sup>. We maken gebruik van een flitslamp 6,7 aan ultraviolette flitsen van toepassing op de ciliaire regio vrij maken cAMP of Ca, terwijl patch-clamp opnames worden genomen om de stroom te meten in de whole-cell voltage-clamp configuratie 8-11.
Discussion
Flash fotolyse van gekooide verbindingen in combinatie met patch-clamp opnames is een handige techniek om een snelle en lokale sprongen te krijgen in de concentratie van fysiologisch actieve moleculen binnen en buiten cellen. Verschillende soorten gekooide compounds1 zijn gesynthetiseerd, en deze techniek kan worden toegepast op verschillende soorten cellen, met inbegrip van gekweekte cellen die ion kanalen die kunnen worden geactiveerd of gemoduleerd door fotolyse van enkele van de beschikbare gekooide verbindingen 11.
Fotolyse van gekooide verbindingen vereist pulsen van hoge intensiteit van de UV-licht om in de buurt van een voldoende hoeveelheid van moleculen vrij maken in een korte tijd. Verschillende lichtbronnen kan worden gebruikt: een continu werkende kwik of xenon-arc lamp bestuurd door een sluiter en gekoppeld aan de epifluorescerende poort van de microscoop, een Xenon flitser lamp, een UV-laser, en de recent ontwikkelde high power UV-licht emitterende diode (LED ). Elk type lichtbron heeft voordelen en nadelentages op basis van de specifieke toepassing en de kosten van het apparaat. Vergeleken met een flash-lamp, de continu werkende lampen hebben een lagere lichtintensiteit en dus de duur van de lichtpulsen gecontroleerd door een sluiter moet worden verhoogd tot enkele honderden ms tot het verkrijgen van een voldoende hoeveelheid Uncaged moleculen. UV-lasers zijn erg duur. High power LED's UV-14 voor flash fotolyse zijn onlangs in de handel verkrijgbaar en kunnen een goed alternatief voor andere methoden te bieden. Echter, een voordeel van flash-lampen is dat ze een breder emissiespectrum dan UV LED's hebben, waardoor het gebruik van verschillende soorten gekooide verbindingen met verschillende spectrale eigenschappen De belangrijkste voordelen op een Xenon flitslamp te gebruiken voor uncaging in onze applicatie zijn: een goede tijdsresolutie, inderdaad de duur van de lichtpuls is ongeveer 1 ms; een breed UV-spectrum dat geschikt is voor fotolyse van moleculen met verschillende fotochemische eigenschappen, de mogelijkheid om te kiezen voor de dubbeltjension van de lichtvlek op de ciliaire regio te verlichten, de mogelijkheid om eenvoudig kiezen uit verschillende lichtintensiteiten 6. Daarnaast is de Xenon flash-lamp een redelijke prijs heeft, is het gemakkelijk geïmplementeerd in een elektrofysiologische set-up, en vereist geen speciaal onderhoud.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
