Summary
Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis המחנה בכלוב או בכלוב Ca לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית.
Abstract
Photolysis של תרכובות בכלוב מאפשר ייצור של עליות מהירה מקומי בריכוז של חומרים פעילים מבחינה פיזיולוגית שונים 1. תרכובות בכלובים הם מולקולות עשה פעילות פיזיולוגית של כלוב כימי ניתן לשבור על ידי הבזק של אור אולטרה סגול. כאן, אנו מראים כיצד ניתן להשיג תיקון-clamp הקלטות בשילוב עם photolysis של תרכובות בכלוב לחקר התמרה חוש הריח של העכבר ניתק עצב ההרחה חושית. תהליך התמרה חוש הריח (איור 1) מתקיים cilia של נוירונים חושי הריח, שם odorant קשירה לקולטנים מובילה כדי להגדיל את המחנה שנפתח מחזורית נוקלאוטיד-מגודרת (CNG) בערוצים 2. כניסה Ca בערוצים מפעילה CNG Ca המופעל ערוצי Cl. אנחנו מראים איך לנתק את הנוירונים מפני אפיתל ההרחה העכבר 3 ואיך להפעיל ערוצי CNG או CA-מופעל על ידי תעלות Cl photolysis המחנה בכלוב 4 או בכלוב Ca 5 </ Sup>. אנו משתמשים מנורת פלאש 6,7 ליישם גלי אולטרה לאזור ריסי אל uncage cAMP או Ca תוך תיקון-clamp הקלטות ננקטים כדי למדוד את הזרם בתצורה מתח מהדק כל תא 8-11.
Discussion
Photolysis פלאש של תרכובות בכלוב בשילוב עם תיקון-clamp ההקלטות היא טכניקה יעילה כדי להשיג קופץ מהירים מקומיים ריכוז מולקולות פעילות פיזיולוגית הן בתוך והן מחוץ לתאים. מספר סוגים של compounds1 בכלוב היה מסונתז, ואת הטכניקה הזאת ניתן ליישם סוגים שונים של תאים, כולל תאים בתרבית להביע תעלות יונים כי יכול להיות מופעל או מווסתת על ידי photolysis של כמה תרכובות בכלוב זמינים 11.
Photolysis של תרכובות בכלוב דורש פולסים של אור בעוצמה גבוהה UV קרוב uncage כמות מספקת של מולקולות בתוך זמן קצר. מקורות אור שונים ניתן להשתמש: פעלו ברציפות כספית או קסנון מנורת קשת נשלט על ידי תריס ו מצמידים לנמל epifluorescent של המיקרוסקופ, פלאש קסנון מנורה, לייזר UV, כוח שפותחה לאחרונה גבוהה UV דיודה פולטת אור (LED ). כל סוג של מקור אור יש את היתרונות והחסרונותtages בהתאם ליישום ספציפי לעלות של המנגנון. לעומת מנורת פלאש, מנורות פעלה ברציפות יש עוצמת אור נמוכה יותר, ולכן משך להבזקי האור נשלטת על ידי הצמצם צריך להיות מוגבר עד כמה מאות מילי שניות כדי לקבל כמות מספקת של מולקולות שברחה מכלוב. לייזרים UV הן יקרות מאוד. הכוח העליון UV נוריות 14 עבור photolysis פלאש הם לאחרונה זמינים מסחרית יכולה לספק אלטרנטיבה טובה לשיטות אחרות. עם זאת, היתרון של מנורות הפלאש שיש להם ספקטרום הפליטה רחב יותר מאשר UV נוריות, המאפשר שימוש של מספר סוגים של תרכובות בכלוב עם מאפיינים שונים של הספקטרום היתרונות העיקריים להשתמש מנורת פלאש קסנון עבור משחררות רפרוף ביישום שלנו הם: טוב רזולוציה הזמן, אכן משך הדופק אור על 1 ms; ספקטרום UV רחב המתאים photolysis של מולקולות עם תכונות פוטו שונים; האפשרות לבחור את מטבעnsion של כתם אור כדי להאיר את האזור ריסי, את האפשרות לבחור בקלות לעוצמות אור שונות 6. בנוסף, פלאש קסנון, מנורת יש בעלות סבירה, הוא מיושם בקלות אלקטרו הגדרת, ואינו דורש תחזוקה מיוחדת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
