Summary
Fotolyse i bur forbindelser tillader produktion af hurtige og lokaliserede stigninger i koncentrationen af forskellige fysiologisk aktive stoffer. Her viser vi hvordan du får patch-clamp optagelser kombineret med fotolyse i bur cAMP eller anbragt i bur Ca for studiet af olfaktoriske transduktion i dissocierede mus lugtesansen sensoriske neuroner.
Abstract
Fotolyse i bur forbindelser tillader produktion af hurtige og lokaliserede stigninger i koncentrationen af forskellige fysiologisk aktive stoffer 1. Caged forbindelser er molekyler lavet fysiologisk inaktiv ved en kemisk bur, der kan brydes af en flash af ultraviolet lys. Her viser vi hvordan du får patch-clamp optagelser kombineret med fotolyse i bur forbindelser til studiet af olfaktoriske transduktion i dissocierede mus lugtesansen sensoriske neuroner. Processen af olfaktoriske transduktion (Figur 1) finder sted i cilia af olfaktoriske sensoriske neuroner, hvor lugtstof binding til receptorer medfører en forøgelse af cAMP, som åbner cyklisk nukleotid-gated (CNG) kanaler 2. Ca indlæg via CNG kanaler aktiverer Ca-aktiverede Cl-kanaler. Vi viser hvordan man kan adskille neuroner fra musen lugtepithelet 3 og hvordan du aktiverer CNG kanaler eller Ca-aktiverede Cl kanaler ved fotolyse i bur cAMP 4 eller bur Ca 5 </ Sup>. Vi bruger en flash lampe 6,7 til at anvende ultraviolet blinker til ciliaere region til uncage lejr eller Ca, mens patch-clamp optagelser er taget for at måle strøm i hel-celle spænding-clamp konfiguration 8-11.
Discussion
Flash fotolyse i bur forbindelser kombineret med patch-clamp optagelser er en teknik til at opnå hurtige og lokale hopper i koncentrationen af fysiologisk aktive molekyler både inden for og uden for cellerne. Flere typer af bur compounds1 er blevet syntetiseret, og denne teknik kan anvendes til forskellige typer af celler, herunder dyrkede celler, der udtrykker ion-kanaler, der kan aktiveres eller afpasses efter fotolyse af nogle af de tilgængelige bur forbindelser 11.
Fotolyse i bur forbindelser kræver pulser af høj intensitet af nær UV-lys til at uncage en tilstrækkelig mængde af molekyler på kort tid. Forskellige lyskilder kan anvendes: en løbende betjent kviksølv eller xenon buelampe kontrolleret af en lukkertid, og koblet til epifluorescerende havnen i mikroskopet, en Xenon blitz lampe, en UV-laser, og den nyligt udviklede høj effekt UV-light emitting diode (LED ). Hver type lyskilde, der er fordele og ulemperlene i henhold til specifik anvendelse, og til omkostningerne af apparatet. Sammenlignet med en flash lampe, har kontinuerligt betjente lamper en lavere lysintensitet og derfor varigheden af lysimpulser kontrolleres af en lukkertid skal øges op til flere hundrede ms for at opnå en tilstrækkelig mængde Uncaged molekyler. UV-lasere er meget dyre. Høj effekt UV lysdioder 14 for flash fotolyse er for nylig kommercielt tilgængelige og kunne give et godt alternativ til andre metoder. Men en fordel ved flash lamper er, at de har en bredere emission spektrum end UV lysdioder, der muliggør brug af flere typer bur forbindelser med forskellige spektrale egenskaber De vigtigste fordele ved at bruge en Xenon blitz lampe til uncaging i vores program er: en god tidsopløsning, ja varigheden af lys puls er omkring 1 ms; et bredt UV-spektrum, der er egnet til fotolyse af molekyler med forskellige fotokemiske egenskaber, mulighed for at vælge den dimension af lysplet at belyse ciliaere regionen mulighed for nemt at vælge forskellige lysstyrker 6. Derudover Xenon flash-lampe har en rimelig pris, er det nemt implementeres i en elektrofysiologiske set-up, og kræver ingen særlig vedligeholdelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
