Summary
Kafesli bileşiklerin Fotoliz çeşitli fizyolojik aktif bileşiklerin konsantrasyonu hızlı ve yerelleştirilmiş artar üretimi sağlar. Burada, kafesli cAMP fotoliz ile kombine veya ayrışmış bir fare koku alma duyusal nöronlarda koku iletimi çalışma için Ca kafesli patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir.
Abstract
Kafesli bileşiklerin Fotoliz hızlı ve yerelleştirilmiş çeşitli fizyolojik olarak aktif bileşikler 1 konsantrasyonu artar üretimi sağlar. Kafesli bileşikler, ultraviyole ışığın bir flash kırılmış olabilir kimyasal bir kafes tarafından fizyolojik olarak inaktif hale moleküllerdir. Burada, ayrışmış fare koku alma duyu nöronlar koku iletimi çalışması için kafesli bileşiklerin fotoliz ile birlikte patch-klemp kayıtları nasıl elde göstermektedir. Reseptörlerine bağlanarak odorant siklik nükleotid kapılı (CNG) kanal 2 açılır cAMP artışına yol açan koku alma duyu nöronlar, kirpikler, koku alma transdüksiyon işlemi (Şekil 1) yer alır . Ca CNG kanallar aracılığıyla giriş aktive Ca-Cl kanalları harekete geçirir. Biz, fare olfaktör epitel 3 ve kafesli cAMP 4 fotoliz veya Ca 5 kafesli CNG kanalları ya da Ca-aktive Cl kanalları nasıl aktif hale getirmek için nöronların nasıl ayırmak </> Destek. Biz tam hücreli gerilim kelepçe yapılandırma 8-11 patch-klemp kayıtları mevcut ölçmek için alınır uncage cAMP veya Ca ultraviyole yanıp söner siliyer bölgeye uygulamak için bir flash lamba 6,7 kullanın.
Discussion
Patch-klemp kayıtları ile birlikte kafesli bileşiklerin Flash fotoliz konsantrasyonu fizyolojik olarak aktif moleküllerin hem iç ve dış hücreleri hızlı ve yerel atlar elde etmek için çok kullanışlı bir tekniktir. Kafesli compounds1 çeşitli türlerde sentezlenen olmuştur ve bu tekniğin, kültür hücreleri aktive olabilir veya bazı kafesli bileşikler 11 fotoliz tarafından modüle iyon kanalları ifade de dahil olmak üzere hücreleri, çeşitli türleri için uygulanabilir.
Kafesli bileşiklerin Fotoliz kısa bir süre içinde molekülleri yeterli miktarda uncage yakın UV ışık yüksek yoğunluklu darbe gerektirir. Çeşitli ışık kaynakları kullanılabilir: sürekli olarak işletilen bir civa veya xenon ark lambası (LED bir çekim tarafından kontrol edilir ve mikroskop, Xenon flaş lambası, UV lazer ve yeni geliştirilen yüksek güç UV ışık yayan diyot epifluorescent portuna birleştiğinde .) Her tür ışık kaynağının avantaj ve dezavantajlıözel uygulama ve cihazların maliyet göre ikiye katlanacaktır. Bir flash lamba ile karşılaştırıldığında, sürekli olarak çalışan lambalar düşük ışık yoğunluğu ve bu nedenle, bir çekim tarafından kontrol edilen ışık darbeleri süresi var Uncaged molekülleri yeterli miktarda elde etmek için birkaç yüz ms kadar artırılması gerekir. UV lazerler çok pahalıdır. Flaş fotoliz için yüksek güç UV LED'ler 14, son zamanlarda ticari olarak mevcuttur ve diğer yöntemlere iyi bir alternatif sağlayabilir . Ancak, flaş lambaları bir avantaj onlar bizim uygulama uncaging için bir Xenon flaş lamba kullanmak için ana avantajları farklı spektral özelliklere sahip kafesli bileşiklerin çeşitli kullanımına izin veren, UV LED'ler daha geniş bir emisyon spektrumuna sahiptir: iyi bir zaman çözünürlüğü olan, gerçekten de hafif bir darbe süresi yaklaşık 1 ms; moleküllerin farklı fotokimyasal özellikleri ile fotoliz için uygun olan geniş bir UV spektrumu; olasılık kuruş seçmek içinsiliyer bölgeyi aydınlatmak için ışık spot nsion kolayca çeşitli ışık şiddetlerinde 6 seçmek için olasılığı. Ayrıca, Xenon flaş lambası, makul bir maliyetle, elektrofizyolojik bir set-up kolayca uygulanan ve özel bir bakım gerektirmez.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom Made | ||
| Filter cube | Olympus Corporation | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments, Inc. | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments, Inc. | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus Corporation | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus Corporation | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige International | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Carl Zeiss, Inc. | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus Corporation | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments, Inc. | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner Instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML | |
| Reagent | Company | Catalogue number | |
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 | |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 | |
| Cysteine | Sigma-Aldrich | C9768 | |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma-Aldrich | C7275 | |
| CsCl | Sigma-Aldrich | C4036 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | D4527 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| KOH | Sigma-Aldrich | P1767 | |
| Leupeptin | Sigma-Aldrich | L0649 | |
| MgCl2 | Fluka | 63020 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| NaPyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 |
References
- Ellis-Davies, G. C. R. Caged compounds: photorelease technology for control of cellular chemistry and physiology. Nat. Methods. 4, 619-628 (2007).
- Pifferi, S., Boccaccio, A., Menini, A. Cyclic nucleotide-gated ion channels in sensory transduction. FEBS Lett. 580, 2853-2859 (2006).
- Bozza, T. C., Kauer, J. S. Odorant response properties of convergent olfactory receptor neurons. J. Neurosci. 18, 4560-4569 (1998).
- Hagen, V., Bendig, J., Frings, S., Eckardt, T., Helm, S., Reuter, D. Highly Efficient and Ultrafast Phototriggers for cAMP and cGMP by Using Long-Wavelength UV/Vis-Activation. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 1045-1048 (2001).
- Kaplan, J. H., Ellis-Davies, G. C. Photolabile chelators for the rapid photorelease of divalent cations. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 6571-6575 (1988).
- Rapp, G. Flash lamp-based irradiation of caged compounds. Methods. Enzymol. 291, 202-222 (1998).
- Gurney, A. M. Flash photolysis of caged compounds. Microelectrodes: Theory and Applications. Montenegro, I., Queiros, M. A., Daschbach, J. L. , Proc. NATO Adv. Study Inst. Portugal. (1991).
- Lagostena, L., Menini, A. Whole-cell recordings and photolysis of caged compounds in olfactory sensory neurons isolated from the mouse. Chem. Senses. 28, 705-716 (2003).
- Boccaccio, A., Lagostena, L., Hagen, V., Menini, A. Fast adaptation in mouse olfactory sensory neurons does not require the activity of phosphodiesterase. J. Gen. Physiol. 128, 171-184 (2006).
- Boccaccio, A., Menini, A. Temporal development of cyclic nucleotide-gated and Ca2+ -activated Cl- currents in isolated mouse olfactory sensory neurons. J. Neurophysiol. 98, 153-160 (2007).
- Sagheddu, C., Boccaccio, A., Dibattista, M., Montani, G., Tirindelli, R., Menini, A. Calcium concentration jumps reveal dynamic ion selectivity of calcium-activated chloride currents in mouse olfactory sensory neurons and TMEM16B-transfected HEK 293T cells. J. Physiol. 588, 4189-4204 (2010).
- Balana, B., Taylor, N., Slesinger, P. A. Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (44), e2189-e2189 (2010).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing Responses of Mouse Olfactory Sensory Neurons Using the Air-phase Electroolfactogram Recording. J. Vis. Exp. (37), e1850-e1850 (2010).
- Bernardinelli, Y., Haeberli, C., Chatton, J. Y. Flash photolysis using a light emitting diode: an efficient, compact, and affordable solution. Cell. Calcium. 37, 565-572 (2005).
