Summary
一个准备从小鼠大脑皮质翻译活跃，完好synaptoneurosomes（SNS）的方法来描述。该方法采用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度，允许快速制备活跃的SNS。
Abstract
Synaptoneurosomes（SNS）小鼠大脑皮质的同质化和分馏后获得的。他们再封好，水疱或离开时，皮层组织匀浆脱离的轴突终端的隔离终端。 SNS的保留前和突触后的特点，这使得它们在突触传递的研究非常有用。他们保留用于神经信号的分子机制，并能够吸收，储存和释放神经递质。
积极SNS的生产和隔离可能会出现问题的使用聚蔗糖，可细胞毒性，并要求延长离心由于密度高，过滤和离心的方法，它可以在低活动导致机械损伤的SNS等媒体。然而，使用不连续Percoll蔗糖密度梯度分离SNS提供了一种快速的方法来产生良好收益的翻译活跃的SNS。 Percoll蔗糖梯度法快速，温和的，因为它采用等渗条件下，有越来越短的离心旋转，并避免离心步骤，颗粒SNS和造成机械损伤。
Protocol
1。准备工作1-4
- 准备一个2.5米的蔗糖浆混合50毫升，500毫升（GM），梯度介质的缓冲，2.5毫升的一个1M的Tris -盐酸，PH7.5股票，0.1毫升0.5 M EDTA，pH值8.0股毫Q水体积。过滤消毒的解决方案，分装和储存冷冻。
- 准备的河豚毒素（TTX）的1000倍的股票，由1毫米的解决方案中的 Milli - Q H 2 O TTX的等分可以储存在-20 ° C
- 准备由Milli - Q水解决了100毫米的Tris（pH值7.5），5毫米的Na 2 HPO 4，4毫米的KH 2 PO 4， 碳酸氢钠 3 40毫米，800毫米氯化钠10X刺激缓冲区。股票可以储存于4 ° C。
- 预冷离心机到4 ° C。
- 股票的等渗Percoll（SIP）解决方案，并准备加入Percoll（18毫升）的9卷1体积为2.5米的蔗糖（2毫升）在Milli - Q水拌匀。
- SIP的款额加入到通用汽车缓冲和混合每个准备3，10，15和23％的梯度层：
- 吹打成贝克曼离心管中倒入2毫升，23，15，10和3％的等渗Percoll解决方案使用一个P1000的吉尔森Pipetman帽梯度层。层与层之间的接口应该清楚没有可辨别的混合层。保存在4 ° C，使用前至少20分钟的梯度。梯度可以存储长达24小时，虽然同一天，建议使用。 [没有经验的实验室人员可能加入蓝色染料isomotic Percoll层界面的可视化解决方案的做法准备梯度。]
2。鼠标清扫1
- 确保所有的鼠标畜牧业和安乐死的程序是按照美国国立卫生研究院和大学准则执行。安乐死的二氧化碳窒息或批准在动物协议的一种方法的幼崽（P13到P21的年龄）。
- 引脚上的鼠标到夹层板和喷涂的颈部和头部用乙醇的背面。通过脊髓削减颅底一个锋利的剪刀，去除皮肤的头骨顶部，横向切割之间的顶骨和interparietal骨之间的大脑和皮层区域的头骨。然后切基地鼻子沿矢状缝合头骨，小心地取出每个半球侧拉软顶骨，并用抹刀删除皮层。插入大脑小脑以上锅铲，然后舀出皮质，并放置在冰冷的通用缓冲区。立即着手同质化的步骤。不要让皮质坐很长时间在冰冷的缓冲区，因为这将造成不利影响形成的SNS。
3。制备匀浆和SNS 1-4
- 在冰冷的通用缓冲冲洗皮质和两个皮层转移到玻璃Dounce匀浆含有5毫升冷通用缓冲区。
- 轻轻同质化的松散杵5-10招皮层（杵的“A”），其次是5-10招紧杵（杵的“B”）。招应迅速，但足够慢，不引起气泡。一个匀浆同质化后的图片是在计划 1 。笔画数会有所不同取决于个人匀浆和随行杵。当完成的梯度应给人以强烈的的SN频段，如果不是，调整笔画数。
- 匀浆转移到15 mL锥形1000xg离心10分钟，在4 °在水平转头C（Allegra的6KR离心机）颗粒细胞碎片和核。纺匀浆的照片是在计划 1 。
- 第2层毫升上清液，每Percoll蔗糖梯度，第管，并在32,500 XG离心5分钟，4 °彗星在一个固定角度转子（美国贝克曼离心机J2 - 21，JA - 17转子）使用适当的适配器（ 试剂和仪器表 ）。
- 移液器起飞和丢弃以上SN频段使用玻璃巴斯德吸管的解决方案。移液器关闭SN频段在15/23％接口，转移到一个圆锥形的冰商店。每个梯度之一皮质会产生0.9-1.1毫升锡。
- 调整的SNS盐的浓度，加入十分之一量的10倍刺激缓冲区，增加1000倍氯化钙 2至终浓度为12纳米，1毫米TTX的股票添加终浓度为1μm，抑制非特异性激发。 （ 氯化钙除了是可选的，如果它会干扰与下游SN应用） 。
- 使用的Micro BCA蛋白检测试剂盒，确定了SNS的蛋白浓度。 （Bradford蛋白测定是不建议，因为从Percoll推断。）
- SNS可以用来直接和迅速的蛋白质translaTION研究。对于其他应用程序的SN裂解可能被清理或集中使用皮尔斯的SDS - PAGE样品制备试剂盒。
4。代表性的成果：
当鼠标皮质匀浆，并在不连续Percoll蔗糖梯度（ 图1），6条带或分数分离被发现（ 图 1 ）。这是以前对大鼠大脑皮层3,5所示的分子量高频段的成分被破坏细胞膜和髓磷脂和颗粒材料中所含的线粒体或细胞器（ 见表1） 。 23％/ 15％的接口（乐队5）含有丰富的SNS。
如前所述，通过电子显微镜（EM）的乐队在23％/ 15％接口包含完整的SNS，删除和检查。2,6电磁显示存在完整的突触小泡与突触前和突触后成分的保存 （图2）。前和突触后车厢分离是很重要的研究信令和蛋白质的合成，其中发生在两个车厢。7-13 Percoll蔗糖梯度是一个粗略的净化，使我们看到在SN分数轻微的细胞，核和细胞器的污染，但整体分离是好的。
用Western blot检测时，Percoll分数包含在SN带（ 图3，表2）增加突触纯度与预期的蛋白标志物。丰富的SN频段（第五级）均保持在突触和神经元的标记，但其他标志物的丰度显着降低。特别是，GFAP的胶质细胞来源的星形胶质细胞和肿瘤细胞的标记，核纤层蛋白B1，核标记，存在几乎可以忽略不计，而维持或加强的结构和突触标记。此外，还有被保留，在蛋白质合成中发挥的作用的细胞器，如线粒体和高尔基的标记。
典型的产量分别为SN频段250-500纳克每微升的蛋白质，BCA蛋白检测确定。 从头蛋白质合成量的确定活动的SNS，目前由[35S]蛋氨酸掺入（ 图 4）作为监测 。2基底翻译活动增加了1.56倍时，SNS与50微米glutamate/10 μM甘氨酸刺激（GLU）或5.12倍的PIN1抑制剂胡桃启动时。 PIN1的抑制作用，增加蛋白质合成。结果证实，[35S]蛋氨酸掺入的增加是由于从头蛋白质的合成，我们增加了40微米茴香霉素，蛋白质合成抑制剂，并看到了在法团的显着下降在基础水平相比，谷氨酸的存在和缺乏。此外，基底翻译时增加2％TRITON - X 100，这破坏了诚信的SNS，下降了75％。此外，当研究表明最突触标记富集乐队（B4 - B6）， SNS或乐队5 从头蛋白质的合成（ 图5）最大的活动。因此，蔗糖不连续Percoll梯度迅速产生一种非常活跃，丰富SN频段，可用于研究蛋白质翻译。
不连续Percoll蔗糖梯度程序比其他方法更有利，因为苛刻的条件所造成的机械损伤。相比的过滤方法，在清除皮质匀浆，是通过一系列过滤器的大小减少，3,14-15 Percoll方法形成了更大的活动更多的SNS。在图6中可以看出，当超过Percoll蔗糖梯度，有远不如SNS在15/23％接口和更大量的碎膜过滤法编制的SNS等分通过。当从头蛋白质合成是通过S35 -会见纳入计量，过滤法编写的SNS远不如积极（ 图7）。为了最大限度地提高翻译活动，我们利用小鼠P14和P18之间。 SN可以从成年小鼠的准备，但我们观察到的显着增加与少年小鼠（ 图8）编写的SN翻译活动。
表1。 3,5 匀浆鼠标皮质不连续Percoll梯度分馏带的成分 。
表2。每个乐队的分数相对西方螺栓不连续Percoll蔗糖梯度带成分分析总结。蛋白浓度隔离使用不连续的PercolWestern blot法测定L -蔗糖梯度。无蛋白（ - ）目前，0≥0.2（+），0.2≥0.8 (++),或> 0.8 (+++)倍大于蛋白质上清（皮质匀浆，离心），代表目前在N = 3。
计划1：一个SN准备使用一个不连续Percoll蔗糖密度梯度的原理图，解剖小鼠大脑皮质，匀浆，并在低速离心除去非均质组织，细胞，整个细胞器， 如原子核和膜。不连续梯度应当有明确定义的层。插图显示的图片，仅供都被染成了蓝色，只有在为了形象化层的层，例如。上清分层不连续Percoll蔗糖梯度上，在中等速度离心。从渐变的SN频段，然后检索，并准备使用。
图1。匀浆分馏上的不连续Percoll蔗糖梯度 。鼠标皮质匀浆，上升至6阶或分数上不连续Percoll蔗糖梯度分离。纯化的，积极的SNS（*）被发现在第五级。
图2。 SN的筹备工作给予了SNS的异构混合保留突触前和突触后成分 。SN的准备从C57BL / 6小鼠（P13到P21的年龄）准备了一份电子显微镜执行先前所描述的，表明SNS保留突触前和突触后的元素。 6个红色箭头指向性突触后密度。比例尺为1微米。
图3。的SN制剂的免疫印迹分析表明，突触和神经元的标记保持在纯化的SNS（第五级），但其他标志物的丰度显着降低。上清免疫印迹的（S，离心皮质匀浆）和不连续频段1-6 Percoll蔗糖梯度被探测的肌动蛋白（β-的结构，装载控制），GFAP（星形），GP73（高尔基），HSC70（细胞质和核），核纤层蛋白B1（核），Prohibitin（线粒体），PSD95（突触后密度），SNAP25（突触），突触（突触）和β3-微管蛋白（神经元特异性）。带可视化使用风暴860 Phosphorimager，N = 3的代表。
图4。 SNS是活动的，展览通过[35S] -蛋氨酸掺入从头蛋白质的合成。SNS预平衡至37 ° C为10分钟。 SNS是未经处理或预处理后15分钟与40微米茴香霉素或1μM胡桃在37 ° C，[35S]此外，气象，20μL快临标签混合S35简易标签，加上或减去谷氨酸37 ° C 30分钟。使用皮尔斯的SDS - PAGE样品制备试剂盒的样品制备，15％的聚丙烯酰胺凝胶上运行，干燥和定量使用一个分子动力学风暴860 phosphorimager，N = 3的代表，± SEM。
图5。从非连续Percoll蔗糖梯度带5条所载从头蛋白质合成的最高水平。乐队4，5和第6和上清液（离心皮质匀浆）预平衡至37 ° C下10分钟。然后，[35S] -蛋氨酸，快临标签混合S35简易标签，增加了，再加上或减去谷氨酸在37 ° C为30分钟。使用皮尔斯的SDS - PAGE样品制备试剂盒的样品制备，15％的聚丙烯酰胺凝胶上运行，干燥和定量使用一个分子动力学风暴860 phosphorimager，N = 3的代表，± SEM。
图6。从过滤法准备的SNS包含更多的碎膜比蔗糖不连续Percoll梯度法准备的SNS少整个SNS。 SNS准备通过一系列如前所述随着孔径的过滤器匀浆皮质 。3,14-15的SNS等分是在一个不连续Percoll蔗糖梯度离心和过滤法编制相比同等数额使用蔗糖不连续Percoll梯度法的材料。
图7。从过滤法编写的SNS包含少从头蛋白质合成活性比SNS准备来回米的不连续Percoll蔗糖梯度法。 SNS准备通过一系列降低孔径的过滤器，如前面所述 ，3,14-15匀浆皮质不连续Percoll蔗糖梯度方法。 SNS都准备工作，预平衡至37 ° C下10分钟。然后，[35S] -蛋氨酸，快临标签混合S35简易标签，增加了，再加上或减去谷氨酸在37 ° C为30分钟。使用皮尔斯的SDS - PAGE样品制备试剂盒的样品制备，15％的聚丙烯酰胺凝胶上运行，干燥和定量使用一个分子动力学风暴860 phosphorimager，N = 3的代表，± SEM。
图8。从年轻小鼠（P13）的SNS有更大的比年纪较大的老鼠（P85）翻译活动 。SNS从不同年龄的小鼠使用Percoll不连续蔗糖梯度法，在37 preequilibrated ° C 10分钟准备，处理或与谷氨酸治疗中存在[35S] -蛋氨酸（快递PRO标签混合S35简易标签）为30分钟，扣冻结，后清理与皮尔斯的SDS - PAGE样品制备试剂盒。 SNS的12％SDS聚丙烯酰胺凝胶上，然后运行，干和分子动力学风暴860 phosphorimager，N = 3，± SEM代表成像。 P14小鼠SNS至少3倍以上的P85小鼠积极。
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Discussion
不连续Percoll蔗糖梯度准备此处所描述的是一个快速，可靠的方法来隔离活跃的SNS，它可以用于各种突触传递的实验。此渐变的方法，它是根据Dunkley等人，3,4开发的方法是一种细胞内的脑分馏过程分离前和突触后膜囊泡与另一个相关的衍生。没有进一步纯化这些SNS兼容多种分子生物学技术，包括免疫，免疫印迹，流式细胞仪，监测从头蛋白质的合成，通过[35S] - MET注册成立后，电子显微镜，以及多种酶的活性检测，包括异构酶激酶活性检测。
不连续Percoll蔗糖梯度程序是比较直截了当，但是，它的关键是解决方案和大脑物质保持在4 °整个筹备和前寒意梯度彗星。虽然匀浆始终保持冰冷，以尽量减少蛋白水解，更大的活动更好的良率，这是最好不要让皮层上坐太久之前同质化冰在通用缓冲。 SNS的形成是最好的皮质冲洗，然后尽快匀浆。然而，匀浆，可保持在冰上前无不良影响的初步离心。速度是一个问题，一旦皮层已收获，所以SNS的隔离应尽快完成。虽然SNS可以保留1-2个小时的高活性，步骤之间的时间长时间会导致活性下降。为SN准备使用的小鼠的年龄也是一个关键问题。此前它已被证明是在啮齿类动物中与年龄有关的突触可塑性下降16-19我们已经看到在SNS同样的效果。虽然年纪较大的老鼠可以用来做翻译活跃的SNS，我们发现，年轻的老鼠（P13）有更大的翻译活动，然后年纪较大的老鼠（P85）。
有几个变化和组合过滤，5,14-15,20-23离心，24日至27日和梯度法26日至29日 ，已被用来准备SNS，每个人都有自身的优势和劣势。过滤和离心法可造成机械损伤的SNS。利用不同孔径大小的过滤器的方法，导致在一个更大比例的碎膜和产量显着减少SNS。我们试图过滤器的方法，5,14-15通过了一系列减少孔径过滤器匀浆，并发现，通过过滤法编制的SNS明显不活跃的。离心的方法也导致机械损伤，由于长时间在高速行驶时，在管的底部颗粒或紧凑的SNS和要求再悬浮旋转。 Percoll采用温和的条件下，避免过滤或造粒的SNS，它可以粉碎或溶解的SNS。 SN的程序，利用28,30-32聚蔗糖或蔗糖4,31还造成损坏或不活跃的SNS molarities，受损的生物学功能和形态学变化。31-32聚蔗糖可能会导致不必要的细胞聚集在生理pH值，并给出渗透压梯度浓度的增加。31-32保持isoosmotic条件，梯度与盐梯度得到应有的补偿。31 SNS与高浓度的蔗糖（1.4-0.8 M）导致更小，不活跃的SNS准备。
不连续Percoll蔗糖的方法克服了许多与其他媒体和离心过程中所涉及的问题。这种方法的一个主要优点是使用Percoll，它具有低粘度，低渗透压和比较没有对细胞的毒性和他们的选民，从而使之更好地适合替代品相比，密度梯度实验 。4,29此外， Percoll可以准备与蔗糖保持渗透压需要保留SN的完整性。（4）使用不连续Percoll蔗糖梯度降低离心时间从30-45分钟至5分钟，从而延长的SNS的使用年限，其中有一个活动的有限寿命。 Percoll梯度的另一个优点是产量高，SNS的活动相比，方法，利用过滤器来形成的SNS。我们跑了超过Percoll蔗糖梯度过滤方法的SNS。我们找到了一个勉强可辨别SN频段和丰富较高分子量梯度碎膜。此外，Percoll方法编写的SNS转化活动明显比与过滤方法。总体而言，Percoll是其他方法更可取，因为它采用温和的条件下，避免过滤和造粒SNS resultin克在突触活动和更好的囊泡形成更大的保留。 3,4等，超过Dunkley，我们的方法的优点是玻璃，玻璃Dounce匀浆被用来损害最突触后的终端附件，并导致突触后元素被暴露在此处反对电机驱动聚四氟乙烯，玻璃匀浆媒体和极少数被封闭胎膜完整。
重要的工作集中在11-13突触后密度蛋白质合成，但很少工作已经完成，研究突触前车厢内蛋白质的合成。但是，有证据表明，蛋白质的合成发生在突触前终端。7-10可以看到，在电子显微镜的SNS，前和突触后的附件，使他们今后的学习转化活动的理想系统存在在SN的编写在这两个车厢。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们要感谢来自威斯康星大学麦迪逊分校电子显微镜设施电子显微镜的大学BK八月。这项工作是由NIH资助R01 - DA026067和P30 - HD03352（JSM）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
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| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
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References
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