I detta protokoll beskriver vi dissektion av efterbörd från musen om graviditet d10.5, följt av isolering av trofoblastceller med en Percoll-gradient. Vi visar då användning av de isolerade cellerna i en Matrigel invasion assay.
Moderkakan är ansvarig för transporten av näringsämnen, gaser och tillväxtfaktorer till fostret, liksom eliminering av avfall. Således brister i placenta utveckling har viktiga konsekvenser för fostret och modern, och är en viktig orsak till embryonal dödlighet. Den stora celltyp av fostrets del av moderkakan är trofoblaster. Primära mus placentala trofoblastceller är ett användbart verktyg för att studera normal och onormal moderkakan utveckling, och till skillnad cellinjer, kan isoleras och användas för att studera trofoblaster i vissa stadier av graviditeten. Dessutom kan primära kulturer av trofoblaster från transgena möss användas för att studera rollen av specifika gener i placentaceller. Protokollet som presenteras här är baserat på beskrivningen av Thordarson et al. 1, i vilken en Percoll-gradient används för att erhålla en relativt ren population trofoblast cell från mus isolerade moderkakor. Det liknar mer allmänt användad metoder för mänsklig trofoblaster cellisolering 2-3. Renhet kan bedömas genom immunocytokemisk färgning av de isolerade cellerna för cytokeratin 7 4. Här är de isolerade cellerna analyserades sedan med användning av en Matrigel invasion analys för att bedöma trofoblast invasivitet in vitro 5-6. De invaderade cellerna analyseras med immuncytokemi och färgas för räkning.
I den här videon visar vi isolering av trofoblastceller från musen moderkakan. Vi visar en in vitro-analys för trofoblast invasion. Med användning av denna procedur, till stor del en, men inte helt, kan ren population av trofoblastceller erhållas. Om ytterligare renhet krävs, kan magnetiska pärlor separation eller flödescytometri utföras, såsom har beskrivits för primära humana trofoblastceller. Rätt längd på kollagenas dissociationssteget måste bestämmas med varje experiment, och kommer att lära med e…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Creative Services team vid University of Missouri Academic Support Center som producerade denna video. Detta arbete stöddes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health & Human Development av National Institutes of Health, licensnummer HD055231
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
Reagent | Amount | Final concentration |
10x Medium 199 | 50ml | 1X |
Hepes | 2.383 g | 0.02M |
sodium bicarbonate | 0.42 g | 0.01M |
Penicllin-Streptomycin | 5 mL | 100 U- 100 μg /ml |
Sterile dH20 | to 500 mL |
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
Reagent | Amount | Final concentration |
Wash Solution | 100 mL | |
DNase | 1 vial (2000 U) | 20 U/mL |
Collagenase | 100 mg | 125 digestion units/mL |
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Collagenase | Sigma | C9891 | This is Clostridium collagenase. Bovine pancreatic collagenase would likely work as well |
NCTC-135 | Sigma | D4263 | Add FBS to 10% |
Matrigel invasion chambers | BD Biosciences | 354481 | |
10x Medium 199 | Sigma | M9163 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
DNase | Sigma | D4263 | |
100 μm Cell strainer | Fisher | 22363549 | |
Antibody to cytokeratin 7 | DAKO | M7018 | Used at 1:100 dilution |
Equipment
Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.