في هذا البروتوكول، ونحن تصف تشريح المشيمة من الماوس على الحمل d10.5، تليها عزل خلايا الأرومة الغاذية باستخدام التدرج Percoll. علينا أن نبرهن ثم استخدام الخلايا المعزولة في مقايسة الغزو matrigel.
Abstract
المشيمة هي المسؤولة عن نقل الغازات، والمغذيات وعوامل النمو على الجنين، وكذلك القضاء على النفايات. وهكذا، عيوب في التنمية المشيمة لها آثار هامة على الجنين والأم، وهي سبب رئيسي من الفتك الجنينية. نوع من الخلايا الرئيسية للجزء من المشيمة الجنين هو الأرومة الغاذية. الأولية خلايا فأر الأرومة الغاذية المشيمة هي أداة مفيدة لدراسة التنمية المشيمة طبيعية وغير طبيعية، وعلى عكس خطوط الخلايا، قد تكون معزولة وتستخدم لدراسة الأرومة الغاذية في مراحل معينة من الحمل. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام الثقافات الأولية من الأرومة الغاذية من الفئران المعدلة وراثيا لدراسة دور جينات معينة في خلايا المشيمة. ويستند بروتوكول المعروضة هنا على وصف من قبل Thordarson وآخرون.1، والذي يستخدم في الانحدار percoll للحصول على الخلايا الأرومة الغاذية نقي نسبيا من السكان مشيمة الماوس معزولة. وهو يشبه إلى استخدام أكثر على نطاق واسعد طرق الإنسان الأرومة الغاذية الخلية 2-3 العزلة. يمكن تقييم النقاء من تلطيخ immunocytochemical للخلايا معزولة عن cytokeratin 7 4. هنا، ثم يتم تحليل الخلايا المعزولة باستخدام مقايسة الغزو matrigel لتقييم الغزو الأرومة الغاذية في المختبر5-6. ويتم تحليل الخلايا التي غزتها كيمياء سيتولوجية مناعية والملون لفرز الأصوات.
Protocol
1. تشريح المشيمة الماوس إعداد أزواج التزاوج من الفئران. على كل من الأيام التالية، تحقق من وجود المكونات copulatory. ويعتبر اليوم الذي تم الكشف عن المكونات 0،5 يوما بعد الجماع (DPC) 7. </l…
Discussion
في هذا الفيديو، ونحن تثبت عزل خلايا الأرومة الغاذية من المشيمة الماوس. ثم نعرض لفحص المختبر في الأرومة الغاذية للغزو. باستخدام هذا الإجراء، وإلى حد كبير، ولكن ليس تماما، يمكن الحصول على السكان نقية من خلايا الأرومة الغاذية. إذا كان مطلوبا المزيد من النقاء، يمكن أن يؤ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أود أن أشكر فريق الخدمات الإبداعية في جامعة ميسوري مركز الدعم الأكاديمي الذي أنتج هذا الفيديو. وأيد هذا العمل من قبل كينيدي شرايفر يونيس المعهد الوطني للصحة والتنمية البشرية للأطفال من المعاهد الوطنية للصحة، ومنحة عدد HD055231
Materials
Specific reagents and equipment:
Wash Solution (filter sterilize after mixing)
Reagent
Amount
Final concentration
10x Medium 199
50ml
1X
Hepes
2.383 g
0.02M
sodium bicarbonate
0.42 g
0.01M
Penicllin-Streptomycin
5 mL
100 U- 100 μg /ml
Sterile dH20
to 500 mL
Dissociation solution (make fresh and filter sterilize)
Reagent
Amount
Final concentration
Wash Solution
100 mL
DNase
1 vial (2000 U)
20 U/mL
Collagenase
100 mg
125 digestion units/mL
Name of the reagent
Company
Catalogue number
Comments
Collagenase
Sigma
C9891
This is Clostridium collagenase.
Bovine pancreatic collagenase would likely work as well
NCTC-135
Sigma
D4263
Add FBS to 10%
Matrigel invasion chambers
BD Biosciences
354481
10x Medium 199
Sigma
M9163
Penicillin-Streptomycin
Invitrogen
15140
DNase
Sigma
D4263
100 μm Cell strainer
Fisher
22363549
Antibody to cytokeratin 7
DAKO
M7018
Used at 1:100 dilution
Equipment Standard cell culture equipment including a CO2 incubator is required. In addition, a centrifuge rotor capable of spinning 50 ml tubes at 30,000 x g is needed. Note that this exceeds the maximum speed of most conical centrifuge tubes and will likely require an Oak Ridge style tube.
Pennington, K. A., Schlitt, J. M., Schulz, L. C. Isolation of Primary Mouse Trophoblast Cells and Trophoblast Invasion Assay. J. Vis. Exp. (59), e3202, doi:10.3791/3202 (2012).