鼠标应用结扎Peyer氏修补肠袢含量评价M细胞的细菌吸收

Summary

在一个专门的卵泡相关Peyer氏斑上皮M细胞在肠道相关淋巴组织的粘膜免疫监视中发挥的重要作用。在这里，我们描述了细菌transcytosis M细胞的评价方法

Abstract

我们的肠道内居住的共生细菌的数量巨大。对胃肠道的黏膜表面不断暴露给他们，并偶尔病原体。肠道相关淋巴组织（GALT）为诱导黏膜免疫反应，这些^{微生物1，2}中发挥了关键作用。要启动黏膜免疫反应，粘膜抗原必须运从肠腔整个组织，如Peyer氏斑淋巴滤泡的上皮屏障。这介导的抗原transcytosis是由专门的上皮^M细胞3， 4。 M细胞是非典型的上皮细胞，积极吞噬大分子物质和微生物。 M细胞与树突状细胞（DCs）和巨噬细胞，靶抗原降解的溶酶体，主要transcytose内在抗原。这种积极通过M细胞的大分子transcytosis提供抗原的根本组织淋巴滤泡D是认为启动抗原特异性黏膜免疫反应的关键。然而，促进M细胞抗原摄取的分子机制在很大程度上是未知的。我们曾报道，糖蛋白2（GP2），特别是肠之间的M细胞的根尖质膜上表示，作为一个transcytotic受体的共生和致病肠杆菌的一个子集，包括大肠杆菌和沙门氏菌血清型鼠伤寒沙门氏菌（鼠伤寒沙门氏菌），通过承认FimH，细菌外膜⁵菌毛类型的组成部分，我。在这里，我们提出了一个鼠标Peyer氏修补肠袢的检测，以评估M细胞的细菌摄取的应用方法。这个方法是鼠标肠袢先前所描述的^6，7含量的改进版本。改进的要点如下：1。异氟醚被用作麻醉剂。 2。约1厘米结扎肠循环includING Peyer氏补丁成立。 3。 M细胞的细菌荧光标记的荧光标记试剂或过度表达的荧光蛋白，如绿色荧光蛋白（GFP）。 4。 M细胞相关的卵泡上皮覆盖Peyer氏补丁与反GP2抗体检测整个安装immunostainig。 5。荧光共聚焦显微镜分析观察M细胞的细菌transcytosis。小鼠Peyer氏补丁肠袢实验可以提供答案，什么样的共生或transcytosed M细胞的致病细菌，并可能导致我们了解如何通过M细胞刺激粘膜免疫系统的分子机制。

Protocol

1。细菌细胞的制备

1. 摆放着数甘油荧光的细菌（如绿色荧光蛋白表达的鼠伤寒沙门氏菌）的LB琼脂平板，含100μg / ml的氨苄青霉素。
2. 文化从单菌落LB琼脂2毫升的新的LB培养基中过夜。
3. 添加0.5毫升细菌培养，直到在600 nm的光密度达到1.0至4.5毫升的新的LB培养基孵育。
4. 收获的细菌细胞，离心（3000 XG，5分钟，4℃）。
5. 弃上清，5.0毫升的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗两次。
6. 5毫升的PBS重悬菌体，并用50μL暂停接种含有约¹⁰ 7菌落形成单位（CFU） 。
7. 在使用荧光标记的细菌的情况下，细菌细胞标记的荧光标记试剂，根据标准协议。

2。一nesthesia

1. 5％（V / V）填充一个小塑料盒（10 × 10 × 5厘米），蒸发异氟醚（流量：200毫升/分钟）与空气混合。
2. 麻醉八个弱十六岁的男性或女性在框中小鼠。
3. 麻醉后，将小鼠进行尸检表。
4. 不断麻醉2％（V / V）的小鼠异氟醚蒸发与空气混合（流量：200毫升/分钟）（ 图1）。这是一个终端程序。

3。结扎Peyer氏补丁循环检测

1. 腹部皮肤，然后切开1厘米削减麻醉小鼠的腹腔腹膜，取出小肠Peyer氏补丁。
2. 结扎肠道缝纫纱，照顾，以避免血管。注：只能绑定一个侧面的肠道，并留下对方松动。
3. 宽松的小号50μL菌悬液或PBS（对照组）用注射器注入结扎Peyer氏补丁循环肠道IDE（ 图2）。
4. 绑定宽松的一面，并关闭鼠标的腹部剪辑。
5. 1小时后，取出结扎Peyer氏补丁循环，安乐死颈椎脱位鼠标。
6. 海关Peyer氏补丁结扎Peyer氏补丁循环。
7. 闪烁的PBS1毫升Peyer氏补丁根尖使用注射器针，去除多余的粘膜液体和细菌。一个额外的两次闪烁Peyer氏补丁。

4。 Peyer氏补丁整装染色和激光共聚焦显微镜分析

1. Peyer氏补丁修复BD Cytofix / Cytoperm冰1小时解决方案。
2. 屋宇署权限/洗5分钟缓冲1毫升Peyer氏补丁洗净三次和然后块1毫升阻止包含0.1％（W / V）皂甙，0.2％（W ​​/ V）BSA的PBS 30分钟就缓冲冰。
3. 加入200倍稀释的抗鼠GP2的单克隆抗体（5微克/毫升）标本检测M细胞。
4. 在室温下2小时或过夜孵育4 ° C。
5. 1毫升冷PBS洗三次，再加入200倍稀释的抗鼠IgG抗体DyLight549（20微克/毫升）的标本共轭。
6. 孵育2小时的冰样本。
7. 1毫升冷PBS洗三次，然后加入50倍稀释Alexa的633标记的鬼笔环肽标本检测F -肌动蛋白。
8. 在冰上孵育2小时。
9. 1毫升冷PBS轻轻冲洗。然后放置在三到四个圆形玻璃盖片，幻灯片和嵌入的标本中30％的甘油PBS溶液幻灯片上（ 图3）。
10. 一个DM - IRE2共聚焦激光扫描显微镜或DeltaVision恢复反卷积显微镜观察标本。

5。代表性的成果：

鼠标的标本例如结扎Peyer氏修补与绿色荧光蛋白伤寒的循环实验murium观察与DeltaVision恢复反卷积显微镜（ 图4）。 GFP的鼠伤寒沙门氏菌是transcytosed由GP2 ⁺ M细胞。可以由M细胞transcytosed的小鼠Peyer氏修补肠袢检测可以识别的一种共生或致病菌。

图1。蒸发异氟醚条件下小鼠的麻醉。汽化异氟醚麻醉专用器具（左侧）提供。

图2。结扎Peyer氏修补肠袢实验总结。荧光菌悬液通过注射器注入肠道松边结扎Peyer氏补丁循环。

图4。结扎Peyer氏修补与GFP的鼠伤寒沙门氏菌循环实验鼠标的例子。 GP2的，这是M细胞特异性标志物⁵报道，染色试样抗鼠GP2的抗体（红色）。与DeltaVision恢复反卷积显微镜观察。 GFP的表达鼠伤寒沙门氏菌是共同本地化与GP2的M细胞的顶质膜和subapical细胞质囊泡（箭头） 。顶，根尖的看法。底部和侧面，外侧意见。比例尺：10微米。

Discussion

结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间通常为1小时观察到M细胞的细菌掺入。在4小时孵化的情况下，细菌往往检测Peyer氏斑的T细胞区。由于蒸发异氟醚吸入麻醉小鼠保持稳定，结扎Peyer氏菌悬液的补丁的孵化时间可延长至观察T细胞Peyer氏补丁区移动的细菌。这个实验的重要的一点是要小心，不要划伤血管结扎肠道时。在不使用GFP表达的细菌的情况下，我们也可以选择使用商业荧光标记试剂荧光标记的细菌。如果试剂可能抑制细菌，你要使用的，附件M细胞上表达的分子，你应该使用特定的抗体，如果有的话，检测纳入细菌。

ontent“的结扎循环检测方法以前描述^6，7我们改善如下一些这种方法：。。。1异氟醚是一个保持小鼠稳定2的麻醉剂使用约1厘米结扎肠袢包括Peyer氏。补丁是成立3。M细胞在细菌是荧光由荧光标签的试剂或过度表达如GFP荧光蛋白标记。4。的卵泡，相关的覆盖Peyer氏补丁上皮M细胞是检测整体的贴装immunostainig与反GP2抗体5。M细胞的荧光细菌transcytosis共聚焦显微镜分析观察。

我们和其他人表现出不同的异种抗原，积极争取进入M细胞。相当数量的病原体， 包括沙门氏菌，志贺氏菌，耶尔森菌属。利用主机入侵^8-10 M细胞。此外，球形体的Helicobacter幽门螺杆菌可能转运到Peyer氏通过M细胞的补丁，这种易位是在胃的^慢性炎症11感应。另一方面，这些病原体侵入M细胞的机制，仍有待完全阐明。我们建议结扎Peyer氏补丁循环检测解剖M细胞在体内的病原体之间的相互作用是一个合适的的实验方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab')2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core