Summary
Um Um passo-ensaio de RT-PCR para a detecção e identificação genogrupo de isolados Norovirus a partir de fezes de crianças, que utiliza iniciadores e sondas de TaqMan específicos para o quadro de leitura aberta 1 (ORF1)-ORF2 região de junção, a região mais conservada do genoma norovírus é descrito. A não-comercial, custo-efetivo método de extração de RNA é detalhado.
Abstract
Os norovírus (NoVs) são a principal causa de surtos de gastroenterite aguda esporádica em todo o mundo em seres humanos de todas as idades. Eles são importante causa de hospitalizações em crianças com impacto na saúde pública semelhante à de Rotavirus. NoVs são vírus de RNA de grande diversidade genética e há uma aparência contínua de novas estirpes. Cinco genogrupos são reconhecidos; GI e GII com seus genótipos e subtipos muitos sendo o mais importante para a infecção humana. No entanto, o diagnóstico de dois genótipos continua a ser problemática, retardando o diagnóstico e tratamento. 1, 2, 3
Para extração de RNA a partir de amostras de fezes, o método mais comumente usado é o QIAmp kit RNA Viral comercial da Qiagen. Este método combina as propriedades de ligação de uma membrana de gel de sílica, buffers que as RNases de controlo e proporcionam ligação óptimas de ARN para a coluna, juntamente com a velocidade de MicroSpin. Este método é simples, rápido e confiável e é carrIED em alguns passos que são detalhados na descrição fornecida pelo fabricante.
O norovírus é apenas a segunda rotavírus como a causa mais comum de diarréia. Diagnóstico norovírus devem estar disponíveis em todos os estudos sobre a patogênese da diarréia, bem como em surtos ou casos de diarréia individuais. Actualmente no entanto diagnóstico norovírus é restrita a poucos centros devido à falta de métodos simples de diagnóstico. Este diagnóstico e tratamento atrasos 1, 2, 3. Além disso, devido aos custos de transporte e regulamentado de buffers corrosivos dentro e entre países o uso desses kits manufaturados coloca problemas logísticos. Como resultado, neste protocolo descrevemos uma alternativa, económica, método in-house que se baseia na lança inicial et al. Método 4 que utiliza as propriedades de ligação de ácidos nucleicos de partículas de sílica, juntamente com as propriedades anti-nuclease de tiocianato de guanidínio .
et ai. 5 é detalhado. A sequenciação do produto de PCR a partir do PCR convencional permite a diferenciação de genótipos pertencentes ao GI e genogrupos GII.
Protocol
1. As amostras de fezes
- As amostras de fezes devem ser armazenadas congeladas a preservar o RNA. Para fazer uma suspensão a 10% fecal, tomar aproximadamente 0,1 g de amostra de fezes descongeladas e completar a 1 ml com PBS.
- Alíquota em 200 ul para evitar repetidos ciclos de congelamento e descongelamento. Armazenar as alíquotas a -70 ° C.
- Descongelar e centrifugar alíquotas a 4.000 g durante 10 min antes da utilização na extracção.
2. Preparação de partículas de sílica para extracção com guanidina e Sílica
- À temperatura ambiente, suspender 30 g de dióxido de silício e completar com dH2O até 250 mL.
- Após 24 horas de sedimentação, remover 215 ml do sobrenadante por sucção. Adicionar de dH2O até 250 mL, e suspender o sedimento de sílica por agitação.
- Após mais 24 horas, remover o sobrenadante por sucção, e ajustar o pH da suspensão de sílica para pH 2,0, utilizando ácido clorídrico (HCl). Alíquota da suspensão de sílica em bot vidroTLEs e autoclave.
3. Preparação de L6 tampão para extração com Guanidina e Sílica
- À temperatura ambiente, preparar L6 tampão por dissolução de 60 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) e 1,3 g de Triton X-100 em 50 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4, e 11 mL de uma 0,2 M EDTA, a solução de pH 8,0.
4. Preparação do Tampão de L2 para extração com Guanidina e Sílica
- À temperatura ambiente, preparar tampão L2 por dissolução de 180 g de tiocianato de guanidínio (GuSCN) em 150 mL de 0,1 M cloridrato de Tris, pH 6,4.
5. Processo de Extracção
- Em cada uma extracção NoV amostra de fezes positiva, como controlo positivo, e água tratada com DEPC, como controle negativo, deve ser incluída.
- Num tubo de centrífuga de micro-misturar o seguinte; 1 mL de tampão de L6, 20 uL de partículas de sílica, e adicionar 200 uL da suspensão de extracto de 10% fecal. Vortex brevemente e deixe à temperatura ambiente por 15 min.
- Centrifugar a suspensão a 6000 g durante 10 s e lavar o sedimento com 1 ml de tampão de L2 duas vezes, seguido por duas lavagens com etanol a 70% e uma vez com acetona. Seca-se o sedimento em um bloco de aquecimento a 56 ° C durante 5 min.
- Hidrato o RNA no pelete de sílica através da adição de 50 uL de RNase dH 2 0. Adicionar 1 mL de RNasin, mistura invertendo o tubo e incubar a 56 ° C durante 15 min.
- Centrifugar durante 3 min a toda a velocidade, numa centrífuga de mesa, e recolher 40 uL do sobrenadante contendo o RNA.
- Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA).
6. Extração alternativa Usando o Comercial RNA Viral RNA QIAamp Kit
As instruções completas são encontradas na prov livretoided com o kit QIAGEN. Resumidamente, o procedimento é como se segue:
- Pipete 560 de Tampão AVL contendo o RNA transportador para um tubo de 1,5 mL, e adicionar 140 uL da suspensão de fezes de 10%. Mix por pulso vórtex para 15 seg. Incubar a RT durante 10 min.
- Adicionar 560 uL de etanol (96-100%) para a amostra e misturar por pulso vórtex durante 15 segundos, depois brevemente centrifugar.
- Aplicar 630 uL desta solução a uma coluna de spin colocado num tubo de recolha de 2 mL. Centrifugar durante 1 min a 6.000 g; então colocar a coluna de spin em um tubo limpo mL 2.
- Lavar a coluna contendo RNA ligados com 500 uL de tampão de AW1 e centrifugar a 6000 g durante 1 min. Coloque em uma coluna de tubo de coleta limpo 2 mL.
- Lavar a coluna com 500 uL de tampão e centrifuga-se AW2 a toda a velocidade (20.000 g ou 14.000 rpm) durante 3 min.
- Coluna de spin em lugar de 1,5 mL tubo limpo micro centrífuga, adicionar 40 água tratada com DEPC-tratada uL e eluir o RNA à velocidade máxima. Repita emce para um uL 80 final de ARN eluídas.
- Quantificar as amostras extraídas de RNA usando Nanodrop 2000 espectrofotômetro (Thermo científico). Em seguida, armazenar a -70 ° C até à sua utilização, até 6 meses. (Nota: A melhor maneira de preservar intacto o RNA total é convertê-la em cDNA).
7. Detecção de norovírus no RNA extraídos por um passo de tempo real de RT-PCR com sondas específicas TaqMan
Instrumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Metodologia
- Limpe e Limpe todas as superfícies de trabalho, pipetas, centrífugas e com RNase AFASTADO para eliminar qualquer contaminação RNase potencial.
- Pipetar o GI e GII NoV triagem mestre mistura de acordo com a Tabela 1. Sondas Primers e Taqman estão listados na Tabela 2.
- Alíquota de 10 uL de master mix adequado a cada tubo de reação.
- Adicionar 5 uL de amostra desconhecida não diluídoRNA, água tratada com DEPC-tratada como controle negativo, ou GI respectivamente GII controlo positivo de RNA, aos poços de reacção correspondentes. Todas as amostras devem ser executados em duplicata. Os controlos positivos e padrões com concentração de 300 ug / uL e 500 ug / uL, respectivamente, foram fornecidas pelo Laboratório Nacional Calicivirus Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC).
- Centrifugar a placa de reacção em 6000 g durante 10 seg.
- Na tela de propriedades do experimento; definir e selecionar um tipo de experimento para a execução. Assegure-se os reagentes TaqMan são apresentados como o tipo de reagentes, e que leitura pré-PCR e amplificação são seleccionados.
- Executar 15 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 3.
- Analisar os resultados.
8. Genotipagem de NoV GI e GII Usando RT-PCR convencional e Sequenciamento
(Não é mencionado no vídeo, já que é um método comum e amplamente utilizado.)
Instrumento. Applied Biosystems StepOne e Sistemas de Tempo StepOnePlus reais PCR com o modelo Quantitec.
Metodologia
- Antes de genotipagem, o genogrupo (GI ou GII) das amostras são determinados pelo rastreio de RT-PCR acima descrito. GI NoV RNA tem de ser amplificada com a mistura mestre genotipagem GI e GII NoV o RNA com a mistura GII mestre genotipagem.
- Pipetar o GI e GII NoV genotipagem mestre mistura conforme a Tabela 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR estão listados na Tabela 5.
- UL alíquota 45 da mistura principal apropriado para tubos de reacção de 0,2 mL.
- Adicionar 5 uL de DEPC tratada com água a cada tubo de controlo negativo, e 5 uL de um pré-filtrada, Nov (GI e / ou GII) RNA positivas para o tubo de reacção correspondente.
- Correr 50 uL reacções usando o perfil térmico na Tabela 6.
- Enviar produtos de PCR containing, pelo menos, 100 ng / uL da região da cápside amplificado para Macrogen Companhia para a purificação e sequenciação. (9700 Grande Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 e US $ 10 por amostra por seqüenciamento).
9. Os resultados representativos
A Figura 1 mostra resultados representativos do Taqman Um passo-RT-PCR, quando usada para RNA de ensaio extraídos a partir de amostras de fezes de crianças diarréicas. O ciclo threshold (Ct) para uma amostra positiva foi fixado em menor ou igual a 37 Ct para GI e GII 39 para Ct. O CT-valores para os controles positivos foram encontrados para ser inferior a 27 e 18 da junção ORF1-ORF2 para GI e GII, respectivamente. Clique aqui para ver maior figura .
A Figura 2
| Mix Master | Concentração final | Volume (uL) |
| H 2 0 PCR | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| RT Mix | 1x | 0,125 |
| 50 mM Cog cartilha R | 1 uM | 0,250 |
| 50 primers F mM Cog | 1mM | 0,250 |
| 10 sonda Anel mM | 1 uM | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* UL 0,250 de cada sonda foi utilizada para o teste GI, enquanto 0,125 L de cada sonda foi utilizada para o teste GII.
Tabela 1. Qiagen Quantitect master mix para triagem GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7.
| Nome | Geno-grupo | Usar | Sequência (5 'para 3') |
| Cog 1R | GI | Cartilha | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | Cartilha | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Cartilha | TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Cartilha | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Anel 1A | GI | Probe | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| 1B Anel | GI | Probe | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | Probe | FAM-TGG GGC GAG GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabela 2. Primer e oligonucleótidos sonda utilizada em tempo real RT-PCR quantitativo para genogrupos I, II (Kageyama et al.,2003) 8.
| Passo | Temp (° C) | Tempo (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | síntese de cDNA |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart activação polimerase Taq |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | Ciclos 45x |
Tabela3. Perfil térmico para uma etapa Taqman em tempo real RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7.
| Mix Master | Concentração final | Volume (uL) |
| H 2 0 PCR | 29,50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR Tampão | 1x | 10,00 |
| 10 mM mistura de dNTP | 0,4 mM | 2,00 |
| Mix enzima | 2,00 | |
| 40 RNasin U / uL | 20 U / uL | 0,50 |
| 10 uM SKF | 0,1 mM | 0,50 |
| 10 SKR mM | 0,1 mM | 0,50 |
| 45,00 |
Tabela 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix para genotipagem GI e GII.
| Nome | Geno-grupo | Usar | Sequência (5 'para 3') |
| G1SKF | GI | Cartilha | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Cartilha | 5'-CCA CAR ACC CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Cartilha | 5'-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | Cartilha | 5'-GCA CCR CCN TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Primers Tabela 5. Utilizados para a amplificação da região C da Região da Cápside (Kojima et ai., 2002). 5
| Passo | Temp (° C) | Tempo (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | síntese de cDNA |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart activação polimerase Taq |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | Ciclos 40X | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Recozimento |
Tabela 6. Perfil térmico para Taqman One-Step RT-PCR.
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Discussion
Usando o económico in-house método para isolar o ácido nucleico a partir de amostras de fezes, obtém-se resultados iguais como com o comercial QIAmp de RNA viral kit de Qiagen, e em conjunto com o TaqMan RT-PCR desenvolvido no nosso laboratório que pode detectar uma ampla gama de NoV genótipos pertencentes ao GI e GII genogrupo. Uma publicação recente da região C protocolo relataram taxas de genotipagem de 78% 6. Uma vez que a diversidade das cepas contemporâneas Nov tem vindo a aumentar nos anos anteriores, a taxa de sucesso vai depender dos desencontros de primers na região C para as amostras sendo testadas. O ensaio é útil para diagnóstico de rotina, pois elimina pós-amplificação de processamento do produto, encurtando assim o tempo de volta em torno do 7. Para além de diagnóstico, este protocolo pode também ser usado para o esclarecimento da epidemiologia de infecções Nov, sendo assim úteis para o controle de saúde pública da doença.
Ao executar o exame RT-PCR, negativos de controle (NC) reações de primers / sonda conjuntos não deve apresentar curvas de crescimento de fluorescência que cruzam a linha limite. Se um falso positivo ocorre com uma ou mais das reacções o conjunto de iniciadores / sonda NF, a contaminação da amostra pode ter ocorrido, e em todos os casos, a execução todo foi invalidado e repetido com a aderência mais rigorosa com as orientações.
Atravessar reacção para o rastreio de RT-PCR foi testada usando o GI e padrões positivos GII fornecido por CDC. Nenhuma reacção cruzada foi observada entre os primers e sondas GI com GII RNA e vice-versa. A reprodutibilidade do rastreio de RT-PCR foi elevada como CT-valores onde semelhante para execuções repetidas com RNA a partir dos controlos positivos. RNA a partir de amostras de fezes crianças que tinham sido encontrados positivo para NoV e tinha Ct-valores entre 20 e 33 onde subsequentemente amplificado pela RT-PCR convencional e enviada para a genotipagem. Cinco amostras positivas com Ct de valores entre 35 e 38 não foram enviados para seqüencialcing como a carga virai onde encontrado para ser demasiado baixo para a amplificação subsequente utilizando o RT-PCR convencional.
Actualmente, a disponibilidade de diagnóstico norovírus é limitada porque os métodos não são capazes de ser implementado em laboratórios locais com apenas equipamento básico. Este diagnóstico atrasos e tratamento nos casos de diarréia individuais ou em surtos. O método kit é confiável e rápido ainda requer uma quantidade significativa de tempo e recursos para o transporte de materiais para os países. O custo é três vezes maior do que o nosso método. Temos mostrado um método auxiliar usando prontamente disponíveis no país e os reagentes para a detecção de NoV que é igualmente simples, rápido e confiável. Este método custo-benefício ignora dependência de materiais adquiridos no exterior, os problemas de regulamentos internacionais e intra-nacional sobre o transporte que finalmente vai levar a um diagnóstico acessível e tratamento rápido de uma das causas mais comuns de gastroenterites virais em children.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer ao Centro Laboratório Nacional Calicivirus for Disease Control and Prevention (CDC) para a dom espécie de alguns aspectos positivos padrão e controle de Nov, e Laboratórios da Escola de Saúde Pública da Universidade Johns Hopkins para a prestação dos reagentes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
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