Summary
Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l'identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell'RNA è dettagliato.
Abstract
Norovirus (NoVs) sono la principale causa di sporadici focolai di gastroenterite acuta in tutto il mondo negli esseri umani di tutte le età. Essi sono causa importante di ospedalizzazione nei bambini con un impatto sulla salute pubblica simile a quella del Rotavirus. NoVs sono virus a RNA di grande diversità genetica e vi è una continua comparsa di nuovi ceppi. Cinque genogruppi sono riconosciuti, GI e GII con i loro numerosi genotipi e sottotipi che sono i più importanti per l'infezione umana. Tuttavia, la diagnosi di questi due genotipi resta problematica, ritardando diagnosi e trattamento. 1, 2, 3
Per l'estrazione di RNA da campioni di feci il metodo più comunemente usato è il kit QIAmp Viral RNA commerciale da Qiagen. Questo metodo combina le proprietà di legame di una membrana di gel di silice, che RNasi buffer di controllo e fornire vincolanti ottimali degli RNA alla colonna insieme alla velocità di MicroSpin. Questo metodo è semplice, veloce ed affidabile ed è carried in alcuni passaggi che sono dettagliati nella descrizione fornita dal produttore.
Norovirus è secondo solo al rotavirus come la causa più comune di diarrea. La diagnosi Norovirus dovrebbero essere disponibili in tutti gli studi sulla patogenesi della diarrea come pure in caso di focolai o di casi di diarrea individuali. Attualmente tuttavia la diagnosi norovirus è limitata a pochi centri a causa della mancanza di semplici metodi di diagnosi. Questa diagnosi ritardi e trattamento 1, 2, 3. Inoltre, a causa dei costi di trasporto e regolamentato di buffer corrosivi all'interno e tra i paesi l'uso di questi kit manufatti pone problemi logistici. Come risultato, in questo protocollo descriviamo alternativa, economico, internamente metodo che si basa sulla originale Boom et al. 4 metodo che utilizza le proprietà di legame di acido nucleico di particelle di silice insieme alle proprietà anti-nucleasi tiocianato di guanidinio .
et al. 5 è dettagliato. Il sequenziamento del prodotto di PCR dal convenzionale PCR consente la differenziazione di genotipi appartenenti al GI e genogruppi GII.
Protocol
1. I campioni di feci
- Campioni di feci devono essere congelati e conservati per conservare l'RNA. Per effettuare una sospensione al 10% nelle feci, prendere circa 0,1 g di campione scongelato e completare a 1 ml con PBS.
- Aliquotare in 200 microlitri per evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. Conservare le aliquote a -70 ° C.
- Sciogliere e centrifugare le aliquote a 4000 g per 10 min prima dell'uso in estrazione.
2. Preparazione di particelle di silice per estrazione con guanidina & Silica
- A RT, sospendere 30 g di biossido di silicio e completare con dH 2 O fino a 250 mL.
- Dopo 24 ore di sedimentazione, rimuovere 215 mL del supernatante mediante aspirazione. Aggiungi dH 2 O fino a 250 mL, e sospendere la silice pellet agitando.
- Dopo altre 24 ore, rimuovere il supernatante mediante aspirazione, e regolare il pH della sospensione di silice a pH 2,0, usando acido cloridrico (HCl). Aliquotare la sospensione di silice in bot vetrostoli e autoclave.
3. Preparazione del L6 tampone per estrazione con guanidina & Silica
- A RT, preparare L6 tampone sciogliendo 60 g di guanidinio tiocianato (GuSCN) e 1,3 g di Triton X-100 in 50 mL di 0,1 M Tris cloridrato, pH 6,4, e 11 mL di una EDTA 0,2 M, pH 8,0 soluzione.
4. Preparazione del tampone L2 per l'estrazione con guanidina & Silica
- A RT, preparare tampone L2 sciogliendo 180 g di guanidinio tiocianato (GuSCN) in 150 mL di 0,1 M Tris cloridrato, pH 6,4.
5. Procedura di estrazione
- In ogni estrazione positivo campione di feci NoV, come controllo positivo, e DEPC acqua trattata, come controllo negativo, dovrebbero essere inclusi.
- In una micro-centrifuga tubo miscelare il seguente: 1 ml di tampone L6, 20 pl di particelle di silice, e aggiungere 200 microlitri della sospensione al 10% di estratto fecale. Vortex brevemente e lasciare a temperatura ambiente per 15 min.
- Centrifugare la sospensione a 6000 g per 10 s e lavare il pellet con 1 ml di tampone L2 due volte, seguito da due lavaggi con 70% etanolo e una volta con acetone. Essiccare il pellet in un blocco di riscaldamento a secco a 56 ° C per 5 min.
- Idratare i RNA della silice pellet aggiungendo 50 pl di RNase-free dH 2 0. Aggiungere 1 ml di RNasin, mescolare capovolgendo la provetta e incubare a 56 ° C per 15 min.
- Centrifugare per 3 min a velocità piena, in una centrifuga da tavolo, e raccogliere 40 pl del supernatante contenente l'RNA.
- Quantificare i campioni di RNA estratti utilizzando NanoDrop 2000 spettrofotometro (Thermo Scientific). Poi conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso, fino a 6 mesi. (Nota: Un modo migliore per preservare intatto l'RNA totale sta convertendo in cDNA).
6. Estrazione alternativa usando l'RNA Commercial QIAamp Viral RNA Kit
Le istruzioni complete si trovano nella prov librettoite con il kit QIAGEN. Brevemente la procedura è la seguente:
- 560 microlitri di tampone Pipettare AVL contenente l'RNA carrier in una provetta da 1,5 ml, e aggiungere 140 microlitri della sospensione fecale al 10%. Mix di impulsi vortex per 15 sec. Incubare a temperatura ambiente per 10 min.
- Aggiungere 560 pl di etanolo (96-100%) al campione e miscelare impulsi vortex per 15 secondi, quindi centrifugare brevemente.
- Applicare 630 pl di questa soluzione ad una colonna di rotazione posto in una provetta di raccolta 2 mL. Centrifugare per 1 min a 6.000 g; quindi inserire la Micro Spin Column in un pulito 2 Tubo mL.
- Lavare la colonna contenente RNA associati con 500 microlitri di tampone AW1 e centrifugare a 6000 g per 1 min. Colonna Mettere in una provetta di raccolta clean 2 mL.
- Lavare la colonna con 500 microlitri di tampone AW2 e centrifugare a piena velocità (20.000 o 14.000 rpm g) per 3 min.
- Colonnine posto in un ambiente pulito 1,5 mL micro-tubo di centrifuga, aggiungere 40 microlitri DEPC trattata con acqua e eluire l'RNA a piena velocità. Ripetere ilce per un finale 80 pl di RNA eluiti.
- Quantificare i campioni di RNA estratti utilizzando NanoDrop 2000 spettrofotometro (Thermo Scientific). Poi conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso, fino a 6 mesi. (Nota: Un modo migliore per preservare intatto l'RNA totale sta convertendo in cDNA).
7. Rilevazione di Norovirus in RNA estratto da One-step Real Time RT-PCR, con specifiche sonde TaqMan
Strumento StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Metodologia
- Pulire e pulire tutte le superfici di lavoro, pipette, centrifughe e con RNasi via per rimuovere qualsiasi contaminazione potenziale RNasi.
- Preparare la GI e GII NoV Master Mix di screening secondo la Tabella 1. Primer e sonde Taqman sono elencati nella Tabella 2.
- Aliquotare 10 pl di master mix appropriato per ciascun tubo di reazione.
- Aggiungere 5 microlitri di non diluito campione sconosciutoRNA, acqua trattata con DEPC come controllo negativo, o GI rispettivamente GII RNA positivo di controllo, ai pozzetti di reazione corrispondenti. Tutti i campioni devono essere eseguiti in duplicato. I controlli positivi e gli standard con concentrazione di 300 ug / ul e 500 mg / pl, rispettivamente, sono stati forniti dalla National Laboratory Calicivirus Center for Disease Control and Prevention (CDC).
- Centrifugare la piastra di reazione a 6.000 g per 10 sec.
- Nella schermata esperimento proprietà; definire e selezionare un tipo di esperimento per la corsa. Assicurarsi reagenti TaqMan sono visualizzati come il tipo di reagenti, e che pre-amplificazione PCR di lettura e sono selezionati.
- Eseguire reazioni 15 pl usando il profilo termico in Tabella 3.
- Analizzare i risultati.
8. Genotipizzazione di NoV GI e GII con i convenzionali RT-PCR e il sequenziamento
(Non è menzionato in questo video perché è un metodo comune e largamente usato.)
Strumento. Applied Biosystems StepOne e StepOnePlus sistemi PCR in tempo reale con il modello Quantitec.
Metodologia
- Prima genotipizzazione, il genogruppo (GI o GII) dei campioni sono determinati dalla proiezione RT-PCR descritto sopra. GI NoV RNA deve essere amplificato con il mix master genotipizzazione GI e GII NoV RNA con il mix GII genotipizzazione master.
- Preparare la GI e GII NoV genotipizzazione Master Mix secondo la Tabella 4. Primers GI SKF / SKR e G2 SKF / SKR sono elencati nella Tabella 5.
- Aliquotare 45 microlitri della master mix appropriato per provette 0,2 ml di reazione.
- Aggiungere 5 microlitri di acqua trattata con DEPC ad ogni provetta di controllo negativo, e 5 pl di pre-screening, NoV (GI e / o GII) RNA positivi per il tubo di reazione corrispondente.
- Eseguire reazioni 50 pl usando il profilo termico in Tabella 6.
- Invia PCR prodotti conteniNing almeno 100 ng / pl della regione amplificata capside a Macrogen Società per la purificazione e sequenziamento. (9700 Hwy grande Seneca. Rockville, MD 20850 e $ 10 per ogni campione di sequenziamento).
9. Risultati rappresentativi
La figura 1 mostra i risultati rappresentativi del Taqman One-Step RT-PCR quando viene utilizzato per test RNA estratto da campioni di feci di bambini diarroiche. Il ciclo di soglia (Ct) per un campione positivo è stato fissato a minore o uguale a 37 Ct per GI e Ct 39 per GII. I valori Ct per i controlli positivi sono risultate meno di 27 e 18 del ORF1-ORF2 bivio per GI e GII, rispettivamente. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2
| Master Mix | Finale Conc | Volume (pl) |
| H 2 0 PCR | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| RT Mix | 1x | 0,125 |
| 50 micron Cog R fondo | 1 pM | 0,250 |
| 50 micron Cog fondo F | 1pM | 0,250 |
| 10 sonda Anello pM | 1 pM | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* 0,250 pl di ciascuna sonda è stato utilizzato per il test GI, mentre 0,125 pl di ciascuna sonda è stato utilizzato per il test GII.
Tabella 1. Qiagen Quantitect master mix per lo screening GI e GII (Trujillo et al., 2006) 7.
| Nome | Geno-group | Utilizzare | Sequenza (5 'a 3') |
| Cog 1R | GI | Primer | CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | Primer | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Primer | TCG ACG TCT CCA TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Primer | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Anello 1A | GI | Sonda | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Anello 1B | GI | Sonda | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | Sonda | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabella 2. Oligonucleotidi primer e sonde utilizzate per quantitativa in tempo reale RT-PCR per genogruppi I, II (Kageyama et al.,2003) 8.
| Passo | Temp (° C) | Tempo (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | sintesi del cDNA |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart Taq polimerasi attivazione |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | Cicli di 45X |
Tavolo3. Profilo termico per One-step Taqman Real time RT-PCR (Trujillo et al., 2006) 7.
| Master Mix | Finale Conc | Volume (pl) |
| H 2 0 PCR | 29,50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR Buffer | 1x | 10,00 |
| 10 mM dNTP Mix | 0,4 mM | 2,00 |
| Enzyme Mix | 2,00 | |
| 40 U / pl RNAsin | 20 U / pl | 0,50 |
| 10 pM SKF | 0,1 pM | 0,50 |
| 10 pM SKR | 0,1 pM | 0,50 |
| 45,00 |
Tabella 4. Qiagen One-Step RT-PCR master mix per la genotipizzazione GI e GII.
| Nome | Geno-group | Utilizzare | Sequenza (5 'a 3') |
| G1SKF | GI | Primer | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Primer | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Primer | 5'-GGG CNT AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | Primer | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Primer Tabella 5. Usato per l'amplificazione della regione C della regione capsidica (Kojima et al., 2002). 5
| Passo | Temp (° C) | Tempo (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | sintesi del cDNA |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart Taq polimerasi attivazione |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | Cicli di 40X | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Ricottura |
Tabella 6. Profilo termico per Taqman One-Step RT-PCR.
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Discussion
Utilizzando la economico in casa metodo per isolare acido nucleico da campioni di feci, si ottengono risultati uguali come con il commerciale Viral QIAmp RNA kit da Qiagen, e insieme con la RT-PCR TaqMan sviluppato nel nostro laboratorio si può rilevare una vasta gamma di NoV genotipi appartenenti al GI e GII genogruppo. Una recente pubblicazione della regione C protocollo riportato tassi di genotipizzazione del 78% 6. Dal momento che la diversità dei ceppi contemporanei nov è andato aumentando negli anni precedenti, il tasso di successo dipenderà dalle incongruenze nei primer in zona C per gli esemplari in prova. Il test è utile per la routine di diagnostica, in quanto elimina post-amplificazione lavorazione dei prodotti, accorciando così la svolta intorno a tempo 7. Oltre a diagnosi, questo protocollo può essere utilizzato anche per chiarire l'epidemiologia delle infezioni nov, essendo così utile per il controllo della salute pubblica di questa malattia.
Quando si esegue lo screening RT-PCR, controllo negativo (NC) per le reazioni di primer / sonda set non deve presentare curve di crescita fluorescenza che attraversano la linea di soglia. In caso di falso positivo si verifica con una o più reazioni NC del primer / sonda set, la contaminazione dei campioni potrebbe essersi verificato, e in tutti questi casi, l'intero percorso è stata invalidata e ripetuta con il più rigoroso rispetto delle linee guida.
Attraversate reazione per lo screening è stato testato RT-PCR utilizzando il GI e GII positivi standard offerto da CDC. Nessuna reazione incrociata è stata osservata tra primer GI e GII con sonde RNA e viceversa. La riproducibilità dello screening RT-PCR è stata elevata come ct-simile per i valori in cui corse ripetute con RNA dei controlli positivi. RNA da campioni di feci bambini che erano stati trovati positivi per NoV e aveva Ct i valori compresi tra 20 e 33 dove successivamente amplificato dal convenzionale RT-PCR e inviato per la genotipizzazione. Cinque campioni positivi con CT-valori compresi tra 35 e 38 non sono stati inviati per la sequenCing come il carico virale in cui risultata troppo bassa per successiva amplificazione utilizzando la RT-PCR convenzionale.
Attualmente, la disponibilità di diagnosi norovirus è limitato in quanto i metodi non possono essere attuate in laboratori locali con solo attrezzature di base. Questa diagnosi ritardi e trattamento in casi di diarrea individuali o in focolai. Il metodo kit è affidabile e veloce ma richiede una notevole quantità di tempo e risorse per il trasporto di materiali nei paesi. Il costo è di tre volte superiore a quella del nostro metodo. Abbiamo dimostrato un metodo di ausiliari pronti per l'uso in paesi reagenti per la rilevazione di NoV che è altrettanto semplice, veloce e affidabile. Questo costo-efficace metodo ignora affidamento su materiali acquistati all'estero, i problemi di normative internazionali e intra-nazionali sul suo trasporto che alla fine porteranno a una diagnosi accessibile e trattamento rapido di una delle cause più comuni di gastroenterite virale in children.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Centro Nazionale Calicivirus Laboratory for Disease Control and Prevention (CDC) per la gentile dono di un positivi standard e di controllo per NoV e laboratori della School of Public Health presso la Johns Hopkins per la fornitura dei reagenti.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
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- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
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- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
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- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
