Summary
One-Step RT-ПЦР для обнаружения и геногруппы идентификации норовирус изолятов детский стул, который использует грунтовки и TaqMan зонды, специфичные для открытой рамки считывания 1 (ORF1) ORF2 области перехода, наиболее консервативные области норовирус генома описано. Некоммерческих, экономически эффективной добычи методом РНК подробно.
Protocol
1. Кала
- Стул пробы должны храниться замороженными сохранить РНК. Для того, чтобы 10% фекальных подвеску, занимает около 0,1 г талой кала и завершить к 1 мл PBS.
- Алиготе в 200 мкл, чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания. Хранить аликвоты при -70 ° C.
- Таяние и центрифуги аликвоты в 4000 г в течение 10 минут перед использованием в добычу.
2. Подготовка частиц кремнезема для добычи с гуанидина и кремния
- В РТ, приостановить 30 г двуокиси кремния, и в комплекте с дН 2 O до 250 мл.
- После 24 часов осаждения, удалите 215 мл супернатант всасывания. Добавить дН 2 O до 250 мл, а также приостановить кремния гранул при встряхивании.
- Еще через 24 часа, удалить супернатант всасывания и регулирования рН кремнезема подвески рН 2,0, с помощью соляной кислоты (HCl). Алиготе кремния суспензии в стеклянных ботловушках и автоклав.
3. Подготовка L6 буфера для экстракции с гуанидина и кремния
- В РТ подготовить L6 буфера путем растворения 60 г роданида гуанидин (GuSCN) и 1,3 г Тритон Х-100 в 50 мл 0,1 М трис-гидрохлорида, рН 6,4, и 11 мл 0,2 М ЭДТА, рН 8,0 раствором.
4. Подготовка буфера L2 для добычи с гуанидина и кремния
- В РТ подготовить L2 буфера путем растворения 180 г роданида гуанидин (GuSCN) в 150 мл 0,1 М трис-гидрохлорида, рН 6.4.
5. Процедура извлечения
- В каждом извлечении NoV положительные образцы стула, в качестве положительного контроля, а DEPC очищенной воды, в качестве отрицательного контроля, должны быть включены.
- В микро-центрифужные пробирки перемешать следующее: 1 мл буфера L6, 20 мкл частиц кремнезема, а также добавить 200 мкл 10% фекальных подвески экстракта. Кратко Vortex и оставить при комнатной температуре в течение 15 мильл.
- Центрифуга подвески в 6000 г в течение 10 с и промыть осадок с 1 мл буфера L2 в два раза, а затем два промывок 70% этанола и один раз с помощью ацетона. Сухие гранулы в сухом блока нагрева при 56 ° C в течение 5 мин.
- Сода РНК в гранулы кремнезема путем добавления 50 мкл РНКазы без дН 2 0. Добавить 1 мкл RNasin, перемешать путем обращения трубки и инкубировать при 56 ° С в течение 15 мин.
- Центрифуга в течение 3 мин на полной скорости, в настольной центрифуге, и собрать 40 мкл супернатант, содержащий РНК.
- Количественная извлеченные образцы РНК с использованием Nanodrop 2000 спектрофотометр (Thermo Scientific). Затем хранить при температуре -70 ° C до использования, до 6 месяцев. (Примечание: лучший способ сохранить общую РНК нетронутыми превращает его в кДНК).
6. Альтернативные Добыча Использование коммерческих РНК QIAamp Вирусная РНК Kit
Подробные инструкции можно найти в буклете провided с комплектом QIAGEN. Вкратце процедура выглядит следующим образом:
- Внесите 560 мкл буфера AVL содержащий носитель РНК в 1,5 мл трубки, и добавить 140 мкл 10% стул подвески. Mix методом широтно-встряхивая в течение 15 сек. Выдержите при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Добавить 560 мкл этанола (96-100%) в образце и смеси методом широтно-встряхивая в течение 15 секунд, а затем кратко центрифуги.
- Применение 630 мкл этого раствора в спину колонке размещены в 2 пробирки мл. Центрифуга в течение 1 мин на 6000 г, а затем поместить спину колонку в чистую 2 мл трубку.
- Промойте колонку, содержащую связанные с РНК 500 мкл буфера AW1 и центрифуги в 6000 г в течение 1 мин. Место колонна в чистом 2 трубками коллекции мл.
- Промойте колонку с 500 мкл буфера AW2 и центрифуги на полной скорости (20,000 г или 14 000 оборотов в минуту) в течение 3 мин.
- Место спина колонку в чистую 1,5 мл микро-центрифужные пробирки, добавить 40 мкл DEPC обработанной воды и элюции РНК на полной скорости. Повторитесе для окончательного 80 мкл элюированных РНК.
- Количественная извлеченные образцы РНК с использованием Nanodrop 2000 спектрофотометр (Thermo Scientific). Затем хранить при температуре -70 ° C до использования, до 6 месяцев. (Примечание: лучший способ сохранить общую РНК нетронутыми превращает его в кДНК).
7. Обнаружение норовирус в Извлеченные РНК один шаг в режиме реального времени RT-PCR с зондами Taqman
Инструмент StepOnePlus Real Time PCR система (Applied Biosystems).
Методология
- Протрите и очистите все рабочие поверхности, пипетки и центрифуги РНКазой AWAY для удаления возможного загрязнения РНКазы.
- Внесите NoV GI и GII скрининг мастер смешивает в соответствии с таблицей 1. Праймеры и зонды Taqman приведены в таблице 2.
- Алиготе 10 мкл соответствующего сочетания мастер каждый реакционную трубку.
- Добавьте 5 мкл неразбавленного неизвестного образцаРНК, DEPC обработанной воды в качестве отрицательного контроля, или GI GII соответственно положительным контролем РНК, соответствующей скважины реакции. Все образцы должны быть выполнены в двух экземплярах. Положительный контроль и стандарты с концентрацией 300 мкг / мкл и 500 мкг / мкл соответственно были предоставлены Национальным кальцивируса лаборатории Центра по контролю и профилактике заболеваний (CDC).
- Центрифуга реакция пластины на 6000 г на 10 сек.
- В окне свойств эксперимента, определить и выбрать тип эксперимента по ходу. Убедитесь, что TaqMan реагентов отображаются в виде реагентов типа, и что Предварительная ПЦР для чтения и усиления будут выбраны.
- Выполните 15 мкл реакций с использованием термопрофиля в таблице 3.
- Анализ результатов.
8. Генотипирование NoV GI и GII Использование обычных RT-PCR и секвенирования
(Это не упомянутые в этом видео, так как это общий и широко используемый метод).
Инструмента. Applied Biosystems StepOne и StepOnePlus ПЦР в реальном времени системы с шаблоном Quantitec.
Методология
- Перед генотипирования геногруппы (GI или ГИИ) образцов определяется скрининг-ПЦР, описанных выше. Г.И. NoV РНК должен быть усилен с мастером И. сочетание генотипов и ГИИ NoV РНК смесью GII генотипа хозяина.
- Внесите NoV GI и GII генотипирования мастер смешивает в соответствии с таблицей 4. Грунтовки Г.И. SKF / SKR и G2 SKF / СКР приведены в таблице 5.
- Алиготе 45 мкл соответствующего Mix Master 0.2 мл пробирок.
- Добавьте 5 мкл DEPC обработанной воды каждый отрицательный трубки контроля и 5 мкл предварительно отобранных, ноябрь (GI и / или ГИИ) положительный РНК в соответствующую трубку реакции.
- Выполните 50 мкл реакций с использованием термопрофиля в таблице 6.
- Отправить продуктов ПЦР ContaiНина не менее 100 нг / мкл усиленный капсида региона Macrogen компании для очистки и последовательности. (9700 Великий Сенека Hwy. Rockville, MD 20850 и $ 10 за образец в последовательности).
9. Представитель Результаты
На рисунке 1 показана представитель результаты Taqman One-Step RT-PCR, когда используется для анализа РНК, выделенной из образцов стула от диарейных детей. Порог цикла (Ct) на положительный образец был установлен на уровне меньше или равна 37 Ct Г.И. и Ct 39 GII. Ct-значения для положительного контроля оказались меньше, чем 27 и 18-ORF1 ORF2 соединения для GI и GII, соответственно. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2
| Master Mix | Окончательный Конц | Объем (мкл) |
| H 2 0 ПЦР | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| РТ Mix | 1x | 0,125 |
| 50 мкМ Cog R грунтовка | 1 мкМ | 0,250 |
| 50 мкМ праймер F Cog | 1мкМ | 0,250 |
| 10 мкМ зонд кольцо | 1 мкМ | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* 0,250 мкл каждой пробы был использован для тестирования Г.И., в то время как 0,125 мкл каждой пробы был использован для тестирования GII.
Таблица 1. Qiagen Quantitect мастер микс для скрининга GI и GII (Трухильо и соавт., 2006) 7.
| Имя | Гено-групп | Использовать | Последовательность (5 'к 3') |
| Cog 1R | Г.И. | Грунтовка | СТТ AGA CGC CAT CAT CAT C ТЯ |
| Cog 1F | Г.И. | Грунтовка | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | ГИИ | Грунтовка | TCG ACG ОСО TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | ГИИ | Грунтовка | CAR GAR BCN ATG TTY СМА TGG ATG AG |
| Кольцо 1A | Г.И. | Зонд | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Кольцо 1B | Г.И. | Зонд | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | ГИИ | Зонд | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Таблица 2. Праймеров и зондов олигонуклеотидов использоваться в режиме реального времени количественный ПЦР для геногрупп I, II (Kageyama и соавт.,2003) 8.
| Шаг | Температура (° C) | Время (мин) | |
| 1 | 50 | 30:00 | синтеза кДНК |
| 2 | 95 | 15:00 | Taq полимераза HotStart активации |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 1:00 | 45X циклов |
Стол3. Тепловой профиль один шаг Taqman в режиме реального времени RT-PCR (Трухильо и соавт., 2006) 7.
| Master Mix | Окончательный Конц | Объем (мкл) |
| H 2 0 ПЦР | 29,50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR буфера | 1x | 10,00 |
| 10 мМ дНТФ Mix | 0,4 мМ | 2,00 |
| Фермент Mix | 2,00 | |
| 40 U / мкл RNAsin | 20 U / мкл | 0,50 |
| 10 мкМ SKF | 0,1 мкМ | 0,50 |
| 10 мкМ SKR | 0,1 мкМ | 0,50 |
| 45,00 |
Таблица 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix для генотипирования GI и GII.
| Имя | Гено-групп | Использовать | Последовательность (5 'к 3') |
| G1SKF | Г.И. | Грунтовка | 5'-CTG CCC ГАА TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | Г.И. | Грунтовка | 5'-ОАС ACC CAR ОСО TTR TAC - '3 |
| G2SKF | ГИИ | Грунтовка | 5'-CNT GGG AGG GCG УВД GCA - 3 |
| G2SKR | ГИИ | Грунтовка | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Таблица 5. Грунтовка используется для усиления области C области капсида (коим и соавт., 2002) 5.
| Шаг | Температура (° C) | Время (мин) | |
| 1 | 60 | 30:00 | синтеза кДНК |
| 2 | 96 | 15:00 | Taq полимераза HotStart активации |
| 3 | 94 | 00:30 | |
| 52 | 1:00 | 40X циклов | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Отжиг |
Таблица 6. Тепловой профиль Taqman One-Step RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование экономических внутренний метод выделения нуклеиновых кислот из образцов кала, получаем одинаковые результаты как с коммерческой QIAmp Вирусная РНК комплект из Qiagen, а вместе с TaqMan-ПЦР в нашей лаборатории мы можем обнаружить широкий спектр NoV генотипов принадлежащих GI и GII геногруппы. В недавней публикации в области C Протокол сообщил генотипирования ставки 78% 6. Поскольку разнообразие современных штаммов NoV увеличивается в предыдущие годы, успех будет зависеть от несоответствия грунтов в области C для образцов проходят испытания. Анализ полезен для рутинной диагностики, как он устраняет после усиления продукта переработки, таким образом сокращая время оборота вокруг 7. Помимо диагностики, этот протокол также может быть использован для выяснения эпидемиологии инфекций ноября, таким образом быть полезным для общественного контроля здоровья от этой болезни.
При запуске скрининг RT-ПЦР отрицательный контроль (НК) реакций на грунт / зонд наборы не должны показывать кривых роста флуоресценции, которые пересекают пороговую линию. Если ложное срабатывание происходит с одним или несколькими НК грунт / зонда набор в реакции, загрязнение пробы, возможно, произошли и во всех подобных случаях, весь пробег был недействительным, и повторяется с соблюдением строгих принципов.
Крест реакция на обследование RT-PCR была протестирована с использованием GI и GII положительных стандартов, предусмотренных CDC. Нет перекрестная реакция наблюдалась между GI праймеры и зонды с ГИИ РНК, и наоборот. Воспроизводимость скрининг-ПЦР была выше, чем значения Ct, где подобные повторных опытов с РНК из положительного контроля. РНК из образцов стула детей, которые были найдены положительные для NoV и имел Ct значения между 20 и 33, где впоследствии усиливается обычным RT-PCR и отправлен для генотипирования. Пять положительных образцов с Ct значения между 35 и 38 не были направлены на последоваcing как вирусная нагрузка, где оказалась слишком низкой для последующего усиления с использованием традиционных RT-PCR.
В настоящее время наличие норовируса диагностики ограничено, потому что эти методы не могут быть реализованы в местных лабораториях только основного оборудования. Это задерживает диагностику и лечение в отдельных случаях диарея или вспышки. В комплект метод является надежным и быстрым но требует значительного количества времени и ресурсов для транспортировки материалов в странах. Стоимость в три раза больше, чем наш метод. Мы показали, вспомогательный метод с использованием легко доступных в стране реагентов для выявления NoV, что столь же просто, быстро и надежно. Это эффективный метод обходит зависимости от материалов, приобретенных за рубежом, проблемы международной и внутри национальных правил по его транспортировке которые в конечном итоге приведет к доступной диагностики и быстрого лечения одного из самых распространенных вирусных причин гастроэнтерита в глildren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Национальный центр лаборатории кальцивируса по контролю и профилактике заболеваний (CDC) за любезное дар стандарт и контроль срабатывания для ноября и лаборатории факультета общественного здравоохранения Университета Джонса Хопкинса для обеспечения реагентами.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
