Summary
Astar ve açık okuma çerçevesi 1 (ORF1)-ORF2 kavşak bölgesidir Norovirüs genomunun en korunmuş bölgeye özgü TaqMan probları kullanan çocuk tabureleri, gelen algılama ve Norovirüs izolatların genogroup belirlenmesi için Tek Adım RT-PCR nitelendirdi. Bir ticari olmayan, maliyet-etkin RNA ekstraksiyon yöntemi ayrıntılı olarak verilmiştir.
Abstract
Noroviruses (NoVs) her yaştaki insanlarda dünya çapında sporadik akut gastroenterit salgınlarının önde gelen nedenidir. Onlar Rotavirüs benzer bir halk sağlığı etkisi olan çocuklarda hastaneye yatış önemli nedenlerindendir. NoVs büyük genetik çeşitlilik RNA virüsleri vardır ve yeni suşlar sürekli bir görünümü vardır. Beş genogroups tanınır; GI ve GII onların birçok genotip ve insan enfeksiyonu için en önemli olan alt tipleri ile. Bununla birlikte, bu iki genotiplerinin tan teşhis ve tedavi geciktirilmesi, bir problem teşkil etmektedir. 1, 2, 3
Dışkı örneklerinden RNA ekstraksiyonu için en sık kullanılan yöntem Qiagen gelen QIAmp viral RNA ticari kiti. Bu yöntem, tamponlar, bir silika jel membran bağlanma özelliklerini birleştiren bir kontrol RNases ve microspin hızı ile birlikte kolonuna RNA bağlama optimum sağlar. Bu yöntem basit, hızlı ve güvenilir ve Carr iseüretici tarafından sağlanan açıklama ayrıntılı olarak bir kaç adımda ied.
Norovirüs ishalin en sık nedeni olarak rotavirüs sadece ikinci. Norovirüs tanı ishal patogenezinde tüm çalışmaların yanı sıra salgınlar ya da bireysel ishal vakası mevcut olmalıdır. Şu anda ancak norovirüs tanı tanı basit bir yöntem olmaması nedeniyle sadece birkaç merkezde sınırlıdır. Bu gecikme teşhis ve tedavi 1, 2, 3. Buna ek olarak, ülke içinde ve arasındaki maliyet ve korozif tamponların düzenlenmiş ulaşım nedeniyle lojistik problemler ortaya çıkarır, bu mamul kitleri kullanın. Sonuç olarak, bu protokolde, orijinal Bom dayalı bir alternatif, ekonomik, in-house yöntemi tarif ark guadinyum tiyosiyanat ile anti-nükleaz özellikleri ile birlikte silika partiküllerinin nükleik asit bağlama özellikleri kullanır. Yöntemi 4 .
ve arkadaşları tarafından tarif primerler kullanılarak. 5 büyük protein son derece değişken N-terminal-kabuk hedef geleneksel bir RT-PCR için ayrıntılı olarak verilmiştir. Konvansiyonel PCR ile PCR ürün Sekanslayan GI ve GII genogroups ait genotiplerinin farklılaşma sağlar.
Protocol
1. Tabure Örnekleri
- Dışkı örnekleri RNA korumak için dondurularak saklanmalıdır. % 10 fekal süspansiyon yapmak için, çözülmüş dışkı örneği yaklaşık 0.1 gr almak ve PBS ile 1 ml'ye tamamlayın.
- Önlemek için 200 ul olarak tablet dondurma ve çözme de ekledi. -70 ° C'de alikots depolamak
- Çözülme ve ekstraksiyon kullanılmadan önce 10 dakika süreyle 4000 g alikotları santrifüjlenir.
2. Guanidin & Silika ile Ekstraksiyon için Silika Parçacıklar hazırlanması
- RT anda, silikon dioksit, 30 gram askıya alma ve 250 mL dH 2 O ile tamamlayın.
- Sedimantasyon 24 saat sonra emme ile süpernatantı 215 ml kaldırın. 250 mL dH 2 O ekleyin ve sallayarak silis pelet askıya.
- Başka bir 24 saat sonra, emme süpernatan kaldırmak ve pH 2.0 'a silika süspansiyonun pH'ı ayarlamak, hidroklorik asit (HCI) kullanılarak. Cam bot kısım silika süspansiyonSu Isıtıcılar ve otoklav.
3. Guanidin & Silika ile Ekstraksiyon için L6 Tampon Hazırlanması
- Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6,4, ve bir 0.2 M EDTA, pH 8.0 11 mL çözelti 50 mL X-100 guadinyum tiyosiyanat, 60 g (GuSCN) ve Triton 1.3 g çözülerek L6 tampon hazırlanır.
4. Guanidin & Silika ile Ekstraksiyon için L2 Tampon Hazırlanması
- Oda sıcaklığında, 0.1 M Tris hidroklorür, pH 6.4 içinde, 150 mL guadinyum tiyosiyanat ile 180 g (GuSCN) eriterek L2 tampon hazırlanır.
5.. Ekstraksiyon Prosedürü
- Her iki ekstraksiyon bir Kas pozitif dışkı örneği, pozitif kontrol ve DEPC işlenmiş su olarak, negatif kontrol olarak dahil edilmelidir.
- Bir mikro-santrifüj tüpünde aşağıdaki karışımı; tampon L6, silika parçacıkların 20 uL 1 mL, ve% 10 dışkı ekstre süspansiyonun 200 uL ekleyebilir. Vortex kısa ve 15 mi RT de bırakınn.
- 10 sn için 6000 g'de santrifüje süspansiyonu ve% 70 etanol ile iki yıkama ve aseton ile bir kez ve ardından, iki kez 1 ml tampon L2 ile pelet yıkanır. 5 dakika süreyle 56 bir kuru ısıtma blok ° C pelet kurutun.
- RNase içermeyen dH 2 0 ile 50 uL ilave edilerek silika pelet içinde hidrat RNA. 15 dakika boyunca RNasin 1 uL, 56 azından ters tüpü ve inkübe tarafından karışımı ° C ekleyin.
- , Bir tezgah üstü santrifüj içinde, tam hızda 3 dk için santrifüje ve RNA içeren süpernatan 40 uL toplayabilir.
- Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir).
6. Ticari RNA QIAamp viral RNA Kiti Kullanarak Alternatif Ekstraksiyon
Tam talimatları kitapçık Prov bulunurQIAGEN kiti ile ided. Aşağıdaki gibi kısaca prosedür:
- Tampon AVL pipetleyin 560 uL 1.5 ml tüp içine taşıyıcı RNA içeren ve% 10 dışkı süspansiyonu 140 uL ekleyin. 15 sn için darbe vorteksleme karıştırın. 10 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
- 15 sn için darbe vorteksleme tarafından örnek ve karıştırın etanol 560 L (96-100%) ekleyin, ardından kısa bir süre santrifüj.
- Bir 2 mL toplama tüpü içine yerleştirilmiş bir dönme kolonuna Bu çözeltinin 630 uL geçerlidir. 6,000 gr az 1 dakika santrifüjleyin, sonra temiz bir 2 ml tüp içine spin kolon yerleştirin.
- 1 dakika için 6,000 g Tampon AW1 ve santrifüj 500 uL ile bağlı RNA içeren sütunun yıkayın. Temiz 2 mL toplama tüpü yerleştirin sütun.
- 3 dakika boyunca tam hızda (20.000 g veya 14.000 rpm) 500 Tampon AW2 arasında uL ve santrifüj ile sütun yıkayın.
- Temiz bir 1.5 mL mikro-santrifüj tüpüne koyun spin kolon, 40 uL DEPC-işlenmiş su ekleyin ve tam hızda RNA Zehir. TekrarlayınYıkanan RNA son 80 uL için ce.
- Nanodrop 2000 spektrofotometre (Termo bilimsel) kullanarak ayıklanan RNA kantifiye. Daha sonra -70 ° C'de saklayın kullanımı kadar, 6 aya kadar. (Not: bozulmamış toplam RNA korumak için daha iyi bir yolu cDNA dönüştürerek edilir).
7. Bir adım Real Time Özgül Taqman problar ile RT-PCR ile Çıkarılan RNA Norovirüs tespiti
Enstrüman StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri (Applied Biosystems).
Metodoloji
- Wipe ve herhangi bir potansiyel RNaz kontaminasyonu gidermek için MESAFEDE RNaz tüm çalışma yüzeyleri, pipetler ve santrifüjler temizleyin.
- Pipetleyin Kas GI ve GII tarama ana Tablo 1'e göre karıştırır. Astarlar ve TaqMan probları Tablo 2'de listelenmiştir.
- Her reaksiyon tüpüne uygun ana karışımı kısım 10 uL.
- Seyreltilmemiş bilinmeyen örneğin 5 uL ekleKarşılık gelen reaksiyon kuyucuklara sırasıyla RNA, DEPC işlenmiş-negatif kontrol olarak su, ya da gastrointestinal GII pozitif kontrol RNA. Tüm örnekleri çoğaltmak çalışması gerekiyor. Sırasıyla 300 mikrogram / uL ve 500 mikrogram / uL konsantrasyonu ile pozitif kontrol ve standartlara Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) tarafından sağlandı.
- 10 sn için 6000 g reaksiyon plaka santrifüjleyin.
- Deney özellikleri ekranında; çalıştırmak için deneme türü tanımlamak ve seçin. TaqMan reaktifler reaktifler tipi ve bunun Ön-PCR okuma ve amplifikasyon seçili olarak görüntülenir emin olun.
- Tablo 3'te termal profilini kullanılarak 15 uL reaksiyonları çalıştırın.
- Sonuçları çözümleyin.
8. Konvansiyonel RT-PCR ve Dizileme kullanarak Kas GI ve GII Genotiplendirme
(Bir ortak ve yaygın olarak kullanılan yöntem var çünkü bu video belirtilen değil.)
Çalgı. Biyosistem StepOne ve Quantitec şablonu ile StepOnePlus Real Time PCR Sistemleri uygulanır.
Metodoloji
- Genotipleme önce, numunelerin genogroup (GI ya GII) RT-PCR ile yukarıda anlatılan tarama ile tespit edilir. GI Kas RNA GII genotipleme ana karışımı ile GI genotipleme master miks ve GII Kas RNA ile amplifiye edilmelidir.
- Pipetleyin Kas GI ve GII genotipleme ana Tablo 4'e göre karıştırır. Astarlar GI SKF / SKR ve G2 SKF / SKR Tablo 5'te listelenmiştir.
- 0.2 ml reaksiyon tüpleri için uygun ana karışımı kısım 45 uL.
- Her bir negatif kontrol tüpüne DEPC işlenmiş su-5 uL, ve ön-elenmiş, Ara (GI ve / veya GII) karşılık gelen reaksiyon tüpüne pozitif RNA'nın 5 uL ekleyin.
- Tablo 6 Isı profili kullanılarak 50 uL reaksiyonları çalıştırın.
- PCR ürünleri contai gönderen az 100 amplifiye kapsid bölgenin uL ng / arınma ve sıralama için Şirket Macrogen için ning. (Sekans başına 9700 Büyük Seneca Hwy. Rockville, MD 20850 ve örnek başına 10 $).
9. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 Taqman ishalli çocukların gaita örnekleri çıkarılan RNA tayini için kullanılan One-Step RT-PCR temsili sonuçlarını gösterir. Olumlu bir örnek için eşik (Ct) GII için GI ve Ct 39 daha az veya CT 37 eşit kabul edildi. Pozitif kontrol için Ct-değerleri 27 ve sırasıyla GI ve GII için ORF1-ORF2 bileşkenin 18 daha az bulunmuştur. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2
| Master Mix | Final Conc | Hacim (uL) |
| H 2 0 PCR | 2.875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6.250 |
| RT Mix | 1x | 0.125 |
| 50 uM Cog R astar | 1 uM | 0.250 |
| 50 uM Cog F astar | 1uM | 0.250 |
| 10 uM Yüzük prob | 1 uM | 0.125/0.250 * |
| 10.00 |
Her bir prob 0,125 uL GII testleri için kullanılan süre her bir prob * 0,250 uL, GI test için kullanılmıştır.
Tarama GI ve GII için Tablo 1. Qiagen Quantitect master miks (Trujillo ve ark., 2006). 7
| Isim | Geno grup | Kullanmak | Dizisi (5 'den 3') |
| Cog 1R | GI | Astar boya | CTT AGA CGC CAT CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | Astar boya | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Astar boya | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Astar boya | ARAÇ GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Halka 1A | GI | Sonda | FAM-AGA TYG CGA TCY SKK GTC CA-BHQ-1 |
| Halka 1B | GI | Sonda | FAM-AGA TCG CGG TCT SKK GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | Sonda | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tablo 2. Primer ve genogroups I, II (Kageyama ve ark. Için gerçek zamanlı kantitatif RT-PCR için kullanılmıştır prob oligonükleotidler,2003). 8
| Adım | Sıcaklık (° C) | Süresi (dk) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA sentezi |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart Taq polimerazı aktive |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45X döngüleri |
Tablo3. Için termal profilini Tek aşamalı Taqman Gerçek zamanlı RT-PCR (Trujillo ve ark., 2006). 7
| Master Mix | Final Conc | Hacim (uL) |
| H 2 0 PCR | 29.50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR Tamponu | 1x | 10.00 |
| 10 mM dNTP Karışım | 0.4 mM | 2.00 |
| Enzim Mix | 2.00 | |
| 40 U / uL RNAsin | 20 U / uL | 0.50 |
| 10 uM SKF | 0.1 uM | 0.50 |
| 10 uM SKR | 0.1 uM | 0.50 |
| 45.00 |
Tablo 4. Qiagen genotipleme GI ve GII için Tek Adım RT-PCR master miks.
| Isim | Geno grup | Kullanmak | Dizisi (5 'den 3') |
| G1SKF | GI | Astar boya | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Astar boya | 5'-CCA ACC ARAÇ CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Astar boya | 5'-CNT GGG AGG KHK ATC DHA A - 3 |
| G2SKR | GII | Astar boya | 5'-CCR CCN DHA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Tablo 5. Primerler kapsid Bölge Bölge C (Kojima ve ark., 2002) ve amplifikasyonu için kullanılır. 5
| Adım | Sıcaklık (° C) | Süresi (dk) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA sentezi |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart Taq polimerazı aktive |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | 40X döngüleri | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Tavlama |
Tablo 6. Taqman Tek Adım RT-PCR için termal profili.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dışkı örneklerinden nükleik asit izolasyonu için yöntem içi ekonomik kullanarak, Qiagen gelen ticari QIAmp viral RNA kiti ile eşit sonuçlar elde ve birlikte TaqMan RT-PCR Laboratuvarımızda geliştirilen ile biz Kas geniş bir algılayabilir GI ve GII genogroup ait genotipler. Bölgenin C protokolünün yeni bir yayın% 78 6 genotipleme oranları bildirdi. Çağdaş Kas suşların çeşitliliğin önceki yıllarda artan bu yana, başarı oranı test edilen numuneler için bölgede C primerlerin uyumsuzluklarını bağlıdır. Böylece zaman 7 civarında dönüş kısaltarak, post-amplifikasyon ürün işleme ortadan kaldırır olarak tayini rutin tanı için yararlıdır. Dışında teşhis, bu protokolü ayrıca, böylece, bu hastalığın sağlık kontrolü için kullanışlı olan, Ara enfeksiyonların epidemiyolojik açıklama için de kullanılabilir.
Tarama çalıştırırken RT-PCR, primer / prob setleri için negatif kontrol (NC) reaksiyonları eşik hattı geçerek floresan büyüme eğrileri sergilemek gerekir. Sahte bir pozitif primer / prob kümesinin NC reaksiyonların bir ya da daha fazlası ile oluşursa, örnek kirlenme oluşmuş olabilir, ve bu tür bütün durumlarda, tüm çalışma geçersiz edildi ve kılavuzlara katı yapışması ile tekrarlanır.
RT-PCR CDC tarafından sağlanan GI ve GII pozitif standartları kullanılarak test edildi taranması için reaksiyon çapraz. Hayır çapraz reaksiyon GII RNA ve tersi ile GI primer ve problar arasında gözlendi. Tarama RT-PCR tekrarlanabilirliği Ct-değerleri olarak yüksek olduğu pozitif kontrol RNA ile tekrar çalışır benzer. RNA Kas pozitif bulundu ve 20 ve daha sonra konvansiyonel RT-PCR ile amplifiye ve genotipleme için gönderilen 33 arasında Ct-değerlerine sahip olmuştu çocukların gaita örnekleri. 35 ve 38 arasında Ct-değerleri ile Beş pozitif örnekler istif için gönderilen değildikonvansiyonel RT-PCR kullanılarak sonraki amplifikasyonu için çok düşük olduğu tespit viral yük gibi dans ediyorum.
Yöntemleri sadece temel donanımları ile yerel laboratuarlarda uygulanması mümkün değildir, çünkü şu anda norovirüs tanı durumu sınırlıdır. Bireysel ishal vakası veya salgınlar Bu gecikmeler tanı ve tedavi. Kiti yöntem güvenilir ve hızlı henüz ülkelere malzemeleri taşımak için zaman ve kaynak önemli miktarda gerektirir. Bizim maliyet yöntemi üç katıdır. Biz eşit, basit, hızlı ve güvenilir Kas tespiti için hazır-mevcut ülke içi reaktifler kullanarak yardımcı bir yöntem göstermiştir. Bu maliyet-etkin bir yöntem malzemelere güvenden, yurtdışında sonuçta ch erişilebilir bir tanı ve birinin hızlı tedavi gastroenterit en sık görülen viral nedenlere götürecek ulaştırma, uluslararası ve ulus-içi düzenlemeler sorunları satın atlarildren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar Kas için bir standart ve kontrol pozitiflerin tür hediye için Hastalık Kontrol ve Önleme Ulusal calicivirus Laboratuvarı Merkezi (CDC) teşekkür ve reaktiflerin sağlanması için Johns Hopkins Halk Sağlığı Okulu Laboratuvarları olacaktır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
