Un One-Step RT-PCR per il rilevamento e l'identificazione genogruppo di isolati Norovirus da feci bambini, che utilizza primer e sonde TaqMan specifiche al telaio di lettura aperta 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma Norovirus è descritto. Un non-commerciale e conveniente metodo di estrazione dell'RNA è dettagliato.
Norovirus (NoVs) sono la principale causa di sporadici focolai di gastroenterite acuta in tutto il mondo negli esseri umani di tutte le età. Essi sono causa importante di ospedalizzazione nei bambini con un impatto sulla salute pubblica simile a quella del Rotavirus. NoVs sono virus a RNA di grande diversità genetica e vi è una continua comparsa di nuovi ceppi. Cinque genogruppi sono riconosciuti, GI e GII con i loro numerosi genotipi e sottotipi che sono i più importanti per l'infezione umana. Tuttavia, la diagnosi di questi due genotipi resta problematica, ritardando diagnosi e trattamento. 1, 2, 3
Per l'estrazione di RNA da campioni di feci il metodo più comunemente usato è il kit QIAmp Viral RNA commerciale da Qiagen. Questo metodo combina le proprietà di legame di una membrana di gel di silice, che RNasi buffer di controllo e fornire vincolanti ottimali degli RNA alla colonna insieme alla velocità di MicroSpin. Questo metodo è semplice, veloce ed affidabile ed è carried in alcuni passaggi che sono dettagliati nella descrizione fornita dal produttore.
Norovirus è secondo solo al rotavirus come la causa più comune di diarrea. La diagnosi Norovirus dovrebbero essere disponibili in tutti gli studi sulla patogenesi della diarrea come pure in caso di focolai o di casi di diarrea individuali. Attualmente tuttavia la diagnosi norovirus è limitata a pochi centri a causa della mancanza di semplici metodi di diagnosi. Questa diagnosi ritardi e trattamento 1, 2, 3. Inoltre, a causa dei costi di trasporto e regolamentato di buffer corrosivi all'interno e tra i paesi l'uso di questi kit manufatti pone problemi logistici. Come risultato, in questo protocollo descriviamo alternativa, economico, internamente metodo che si basa sulla originale Boom et al. 4 metodo che utilizza le proprietà di legame di acido nucleico di particelle di silice insieme alle proprietà anti-nucleasi tiocianato di guanidinio .
<p class=> "Jove_content" Per l'individuazione e la genogrouping (GI e GII) NoVs di isolati da campioni di feci, diversi RT-PCR che utilizzano protocolli diversi target sono stati sviluppati. Il consenso è che una RT-PCR TaqMan utilizzando la chimica sarebbe la migliore tecnica molecolare per la diagnosi, perché unisce alta sensibilità, specificità e riproducibilità con elevata produttività e facilità d'uso. Qui si descrive un saggio di targeting la lettura aperta telaio 1 (ORF1)-ORF2 regione di giunzione, la regione più conservata del genoma NoV e quindi più adatto per la diagnosi. Per ulteriori analisi genetica un convenzionale RT-PCR che gli obiettivi del altamente variabile N-terminale-shell dal principale proteina del capside (Regione C) utilizzando primers originariamente descritti da Kojima et al. 5 è dettagliato. Il sequenziamento del prodotto di PCR dal convenzionale PCR consente la differenziazione di genotipi appartenenti al GI e genogruppi GII.Utilizzando la economico in casa metodo per isolare acido nucleico da campioni di feci, si ottengono risultati uguali come con il commerciale Viral QIAmp RNA kit da Qiagen, e insieme con la RT-PCR TaqMan sviluppato nel nostro laboratorio si può rilevare una vasta gamma di NoV genotipi appartenenti al GI e GII genogruppo. Una recente pubblicazione della regione C protocollo riportato tassi di genotipizzazione del 78% 6. Dal momento che la diversità dei ceppi contemporanei nov è andato aumentando negli anni …
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare il Centro Nazionale Calicivirus Laboratory for Disease Control and Prevention (CDC) per la gentile dono di un positivi standard e di controllo per NoV e laboratori della School of Public Health presso la Johns Hopkins per la fornitura dei reagenti.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
Triton X 100 | BDH Chemicals | 14530 | |
Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | QIAGEN | 52906 | |
QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | QIAGEN | 204443 | |
Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | QIAGEN | 210212 | |
Rnase Inhibitor 2000 units | A.Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |