Summary
En One-Step RT-PCR-test for påvisning og genogroup identifikasjon av norovirus isolater fra barns avføring, som benytter primere og TaqMan sonder som er spesifikke for den åpne lesing ramme 1 (ORF1)-ORF2 veikryss regionen, den mest bevarte delen av Norovirus genom er beskrevet. En ikke-kommersiell, kostnadseffektiv RNA ekstraksjon metode er beskrevet.
Abstract
Noroviruses (NoVs) er den ledende årsak til utbrudd av sporadisk akutt gastroenteritt i verden i mennesker i alle aldre. De er viktig årsak til sykehusinnleggelser hos barn med en innvirkning på folkehelsen lik som Rotavirus. NoVs er RNA virus av stor genetisk mangfold, og det er en kontinuerlig dukker opp nye stammer. Fem genogroups er anerkjent, GI og GII med sine mange genotyper og subtyper er de viktigste for human smitte. Men fortsatt er diagnosen av disse to genotypene problematisk, forsinke diagnose og behandling. 1, 2, 3
For RNA ekstraksjon fra avføring prøver den mest brukte metoden er QIAmp Viral RNA kommersielle kit fra Qiagen. Denne metoden kombinerer bindende egenskapene til en silikagel membran, buffere som kontroll RNases og gir optimal binding av RNA til kolonnen sammen med hastigheten på microspin. Denne metoden er enkel, rask og pålitelig, og er Carrstudert ute i noen få trinn som er beskrevet i beskrivelsen gitt av produsenten.
Norovirus er andre bare til rotavirus som den vanligste årsaken til diaré. Norovirus diagnose bør være tilgjengelig i alle studier på patogenesen av diaré samt i utbrudd eller individuelle diarétilfeller. I dag derimot norovirus diagnose er begrenset til bare noen få sentre på grunn av mangel på enkle metoder for diagnose. Dette forsinkelser diagnose og behandling 1, 2, 3. I tillegg, på grunn av kostnader og regulert transport av korrosive buffere innen og mellom land bruker av disse produserte pakkene utgjør logistiske problemer. Som et resultat, i denne protokollen beskriver vi en alternativ, økonomisk, in-house metode som er basert på den originale Boom et al. Metode 4 som bruker nukleinsyre bindende egenskaper av silika partikler sammen med anti-nuclease egenskaper guanidinium thiocyanate .
et al. 5 er detaljert. Sekvensering av PCR produktet fra konvensjonell PCR muliggjør differensiering av genotyper som tilhører GI og Gii genogroups.
Protocol
1. Avføringsprøver
- Avføringsprøver bør oppbevares fryst å bevare RNA. For å gjøre en 10% fecal suspensjon, ta ca 0,1 g tint avføringsprøve og fullføre til 1 ml med PBS.
- Delmengde i 200 mL å unngå gjentatt frysing og tining. Oppbevar alikvoter ved -70 ° C.
- Tine og sentrifuger alikvoter på 4000 g i 10 min før bruk i utvinning.
2. Utarbeidelse av silika partikler for ekstraksjon med Guanidine & Silica
- Ved RT, suspendere 30 g av silisiumdioksid og fullføre med dH 2 O til 250 ml.
- Etter 24 timer med sedimentering, fjerne 215 ml av supernatanten ved suging. Legg dH 2 O til 250 ml, og suspendere silika pellet ved å riste.
- Etter ytterligere 24 timer, fjerner supernatanten ved suging, og justere pH av silika suspensjonen til pH 2,0, med saltsyre (HCl). Delmengde silika suspensjon i glass bottles og autoklav.
3. Utarbeidelse av L6 buffer for ekstraksjon med Guanidine & Silica
- Ved RT, forberede L6 buffer ved å løse opp 60 g av guanidinium thiocyanate (GuSCN) og 1,3 g Triton X-100 i 50 ml 0,1 M Tris hydroklorid, 6,4 pH, og 11 ml av en 0,2 M EDTA, pH 8,0 løsning.
4. Utarbeidelse av L2 buffer for ekstraksjon med Guanidine & Silica
- Ved RT, forberede L2-buffer ved å løse opp 180 g guanidinium thiocyanate (GuSCN) i 150 ml 0,1 M Tris hydroklorid, 6,4 pH.
5. Utvinning Prosedyre
- I hvert utvinning ett nov positiv avføringsprøve, som positiv kontroll, og DEPC behandlet vann, som negativ kontroll, bør inkluderes.
- I en mikro-sentrifugerør blande følgende; 1 mL L6 buffer, 20 mL av silika partikler, og legge til 200 mL av 10% fecal ekstrakt suspensjon. Vortex kort og la på RT for 15 min.
- Sentrifuger suspensjonen ved 6000 g for 10 s og vask pellet med 1 ml buffer L2 to ganger, etterfulgt av to vasker med 70% etanol og én gang med aceton. Tørk pelleten i en tørr varme blokk ved 56 ° C i 5 min.
- Hydrat RNA i silika pellet ved å legge 50 mL av RNase-frie dH 2 0. Tilsett 1 mL av RNasin, bland ved å snu røret og Inkuber ved 56 ° C i 15 min.
- Sentrifuger for 3 min ved full fart, i en tabletop sentrifuge, og samle 40 mL av supernatanten som inneholder RNA.
- Kvantifisere de utpakkede RNA prøver ved hjelp Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo vitenskapelig). Deretter lagres ved -70 ° C inntil bruk, opp til 6 måneder. (Merk: En bedre måte å bevare total RNA intakt konverterer den til cDNA).
6. Alternativ Utvinning Bruke Commercial RNA QIAamp Viral RNA Kit
Fullstendige instruksjoner finnes i heftet provided med Qiagen kit. Kort prosedyren er som følger:
- Pipetter 560 mL buffer AVL inneholder carrier RNA inn i en 1,5 ml rør, og legge til 140 mL av 10% avføring suspensjon. Mix av puls-virvling for 15 sek. Inkuber ved RT i 10 min.
- Legg 560 mL etanol (96-100%) til prøven og bland med puls-virvling for 15 sekunder, deretter raskt sentrifuger.
- Påfør 630 mL av denne løsningen til en spin kolonne plassert i en 2 ml samling tube. Sentrifuger i 1 minutt ved 6000 g, og plasser deretter spinn kolonnen i en ren 2 ml tube.
- Vask kolonnen inneholder innbundne RNA med 500 mL buffer AW1 og sentrifuger ved 6000 g for 1 min. Plasser kolonnen i en ren 2 mL samling tube.
- Vask kolonnen med 500 mL buffer AW2 og sentrifuger ved full hastighet (20 000 g eller 14 000 rpm) for 3 min.
- Plasser spin kolonne i en ren 1,5 mL mikro-sentrifugerør, tilsett 40 mL DEPC-behandlet vann og Eluer RNA ved full hastighet. Gjenta påce for en endelig 80 mL av eluted RNA.
- Kvantifisere de utpakkede RNA prøver ved hjelp Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo vitenskapelig). Deretter lagres ved -70 ° C inntil bruk, opp til 6 måneder. (Merk: En bedre måte å bevare total RNA intakt konverterer den til cDNA).
7. Påvisning av Norovirus i utpakkede RNA ved ett-trinns Real Time RT-PCR med spesifikke TaqMan Probes
Instrument StepOnePlus Real Time PCR Systems (Applied Biosystems).
Metodikk
- Tørk og Rengjør alle arbeidsflater, pipetter og sentrifuger med RNase BORTE å fjerne eventuelle RNase forurensning.
- Pipet i NOV GI og GII screening Master Mix henhold til tabell 1. Primere og Taqman prober er listet i tabell 2.
- Delmengde 10 mL av passende Master Mix til hvert reaksjonsrøret.
- Tilsett 5 mL av ufortynnet ukjent prøveRNA, DEPC-behandlet vann som negativ kontroll, eller GI henholdsvis GII positiv kontroll RNA, til de tilsvarende reaksjonsbrønnene. Alle prøvene skal kjøres i duplikat. Positive kontroller og standarder med konsentrasjon på 300 mikrogram / mL og 500 mikrogram / mL henholdsvis ble gitt av National calicivirus Laboratory Center for Disease Control and Prevention (CDC).
- Sentrifuger reaksjonsplaten på 6000 g for 10 sek.
- I forsøket egenskaper skjermen, definere og velge en type eksperiment for løpet. Pass på TaqMan reagenser vises som reagenser type, og at Pre-PCR lest og forsterkning er valgt.
- Kjør 15 mL reaksjoner ved bruk av termisk profil i tabell 3.
- Analysere resultatene.
8. Genotyping av NOV GI og GII med konvensjonelle RT-PCR og sekvensering
(Det blir ikke nevnt i denne videoen, siden det er en vanlig og mye brukt metode.)
Instrument. Applied Biosystems StepOne og StepOnePlus Real Time PCR Systemer med Quantitec malen.
Metodikk
- Før genotyping, er det genogroup (GI eller GII) av prøvene fastsettes av screening RT-PCR beskrevet ovenfor. GI NOV RNA må forsterkes med GI genotyping mester mix og GII nov RNA med GII genotyping mester mix.
- Pipet i NOV GI og GII genotyping Master Mix henhold til tabell 4. Primere GI SKF / SKR og G2 SKF / SKR er oppført i tabell 5.
- Delmengde 45 mL av den aktuelle Master Mix til 0,2 ml reaksjon rør.
- Tilsett 5 mL av DEPC-behandlet vann til hvert negativ kontroll rør, og 5 mL av pre-screenet, nov (GI og / eller GII) positive RNA til den tilsvarende reaksjonen tube.
- Kjør 50 mL reaksjoner ved bruk av termisk profil i tabell 6.
- Send PCR produktene containing på minst 100 ng / mL av den forsterkede kapsid regionen til Macrogen Selskapet for rensing og sekvensering. (9700 Flott Seneca Hwy. Rockville, 20850 MD og $ 10 per prøve per sekvensering).
9. Representative Resultater
Figur 1 viser representative resultater fra Taqman One-Step RT-PCR når den brukes til analysen RNA hentet fra avføringsprøver fra diaré barn. Terskelen syklus (CT) for en positiv prøve ble satt til mindre eller lik Ct 37 for GI-og CT-39 for GII. CT-verdiene for de positive kontrollene ble funnet å være mindre enn 27 og 18 i ORF1-ORF2 knutepunkt for GI og GII, henholdsvis. Klikk her for å se større figur .
Figur 2
| Master Mix | Endelig Conc | Volum (mL) |
| H 2 0 PCR | 2.875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6.250 |
| RT Mix | 1x | 0.125 |
| 50 mikrometer Cog R primer | 1 mM | 0.250 |
| 50 mikrometer Cog F primer | 1mM | 0.250 |
| 10 mm Ring probe | 1 mM | 0.125/0.250 * |
| 10.00 |
* 0,250 mL av hver sonde ble brukt for GI testing, mens 0.125 mL av hver sonde ble brukt til GII testing.
Tabell 1. Qiagen Quantitect mester miks for screening GI og GII (Trujillo et al., 2006). 7
| Navn | Geno-gruppe | Bruk | Sequence (5 'til 3') |
| Cog 1R | GI | Primer | CTT AGA CGC CAT CAT CAT Tya C |
| Cog 1F | GI | Primer | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | GII | Primer | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | GII | Primer | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Ring 1A | GI | Probe | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring 1B | GI | Probe | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | GII | Probe | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabell 2. Primer og probe oligonukleotider brukes til sanntids kvantitativ RT-PCR for genogroups I, II (Kageyama et al.,2003). 8
| Trinn | Temp (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA syntese |
| 2 | 95 | 15:00 | HotStart Taq polymerase aktivering |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45x sykluser |
Bord3. Termisk profil for ett-trinns Taqman Real tid RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7
| Master Mix | Endelig Conc | Volum (mL) |
| H 2 0 PCR | 29.50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR buffer | 1x | 10.00 |
| 10 mM dNTP Mix | 0,4 mm | 2,00 |
| Enzyme Mix | 2,00 | |
| 40 U / mL RNAsin | 20 U / mL | 0,50 |
| 10 mm SKF | 0,1 mM | 0,50 |
| 10 mM SKR | 0,1 mM | 0,50 |
| 45.00 |
Tabell 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master Mix for genotyping GI og GII.
| Navn | Geno-gruppe | Bruk | Sequence (5 'til 3') |
| G1SKF | GI | Primer | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Primer | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | GII | Primer | 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | GII | Primer | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Tabell 5. Primere brukes til forsterkning av Region C kapsid Region (Kojima et al., 2002). 5
| Trinn | Temp (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA syntese |
| 2 | 96 | 15:00 | HotStart Taq polymerase aktivering |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | 40X sykluser | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Annealing |
Tabell 6. Thermal profil for Taqman One-Step RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruke økonomiske in-house metode for å isolere nukleinsyre fra avføringsprøver, får vi like resultater som med den kommersielle QIAmp Viral RNA kit fra Qiagen, og sammen med TaqMan RT-PCR utviklet i vårt laboratorium kan vi oppdage et bredt spekter av nov genotyper som tilhører GI og GII genogroup. En fersk publikasjon av regionen C-protokollen rapportert genotyping priser på 78% 6. Siden mangfoldet av samtidens nov stammer har vært økende i løpet av foregående år, vil suksessraten avhenge av ikke samsvarer med primere i regionen C for de prøvene som blir testet. Den analysen er nyttig for rutinemessig diagnostisk som det eliminerer post-forsterkning produktet behandling, og dermed forkorte snu tid 7. Bortsett fra diagnose, kan denne protokollen også brukes for å avklare epidemiologi nov infeksjoner, og dermed være nyttig for folkehelsen kontroll av denne sykdommen.
Når du kjører screening RT-PCR, negativ kontroll (NC) reaksjoner for primer / probe sett bør ikke utvise fluorescens vekstkurver som krysser terskelen linjen. Hvis en falsk positiv oppstår med en eller flere av primer / probe sett sin NC reaksjoner, kan prøvekontaminering har skjedd, og i alle slike tilfeller, ble hele run oppheves og gjentas med strengere tilslutning til retningslinjene.
Kryss reaksjon for screening RT-PCR ble testet ved hjelp av GI og Gii positive standarder gitt av CDC. Ingen kryss reaksjon ble observert mellom GI primere og prober med GII RNA og vice versa. Den reproduserbarhet screening RT-PCR var høy som Ct-verdier der tilsvarende for gjentatte løyper med RNA fra de positive kontroller. RNA fra barn avføringsprøver som hadde blitt funnet positive for NOV og hadde CT-verdier mellom 20 og 33 der senere forsterket av den konvensjonelle RT-PCR og sendt til genotyping. Fem positive prøver med CT-verdier mellom 35 og 38 ble ikke sendt for Sekvenscing som virusmengde der funnet å være for lav for påfølgende forsterkning ved hjelp av konvensjonelle RT-PCR.
Foreløpig er tilgjengeligheten av norovirus diagnose begrenset fordi metodene ikke er i stand til å bli implementert i lokale laboratorier med bare grunnleggende utstyr. Dette forsinkelser diagnose og behandling i de enkelte diarétilfeller eller i utbrudd. Settet metoden er pålitelig og rask likevel krever en betydelig mengde tid og ressurser til å transportere materialer til land. Kostnaden er tre ganger så stor som vår metode. Vi har vist en hjelpemotor som bruker lett-tilgjengelige i-land reagenser for påvisning av NOV som er like enkel, rask og pålitelig. Dette kostnadseffektiv metode forbigår avhengighet materialer kjøpt i utlandet, problemene med internasjonale og intra-nasjonale forskrifter om transport sin som til slutt vil føre til et tilgjengelig diagnose og rask behandling av en de vanligste virale årsaker til gastroenteritt i lmildren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke National calicivirus Laboratory Center for Disease Control and Prevention (CDC) for den type gave av en standard og kontroll positive for NOV, og Laboratories av School of Public Health ved Johns Hopkins for å gi reagensene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
