Summary
En enstegs RT-PCR-analys för detektion och gengrupp identifiering av Norovirus isolat från barn avföring, som utnyttjar primers och TaqMan-prober är specifika för den öppna läsramen 1 (ORF1)-ORF2 förbindelseregion, den mest konserverade regionen av Norovirus genomet är beskrivits. En icke-kommersiell, kostnadseffektiv RNA-extraktion metod detaljerade.
Abstract
Norovirus (NoVs) är den vanligaste orsaken till utbrott av sporadisk akut gastroenterit i hela världen hos människor i alla åldrar. De är viktiga orsak till sjukhusinläggningar hos barn med en inverkan på folkhälsan som liknar rotavirus. NoVs är RNA-virus med stor genetisk mångfald och det finns en kontinuerlig uppkomsten av nya stammar. Fem genogrupper redovisas, GI och GII med sina många genotyper och subtyper är det viktigaste för människor infektion. Emellertid förblir diagnos av dessa två genotyper problematisk, fördröja diagnos och behandling. 1, 2, 3
För RNA-extraktion från avföringsprover den vanligast använda metoden är den QIAmp virala RNA kommersiellt kit från Qiagen. Denna metod kombinerar de bindande egenskaperna hos en silikagel-membran, buffertar som kontrollerar RNaser och tillhandahåller optimal bindning av RNA till kolonnen tillsammans med den hastighet MicroSpin. Denna metod är enkel, snabb och pålitlig och CarrIED i några steg som anges i den beskrivning som tillhandahålls av tillverkaren.
Norovirus är näst rotavirus som den vanligaste orsaken till diarré. Norovirus diagnosen bör finnas i alla studier av patogenes av diarré samt utbrott eller enskilda fall diarré. För närvarande dock norovirus diagnosen är begränsad till endast ett fåtal centra på grund av bristen på enkla metoder för diagnos. Detta fördröjningar diagnos och behandling 1, 2, 3. På grund av kostnader och reglerad transport av korrosiva buffertar inom och mellan länder användning av dessa tillverkade satser utgör logistiska problem. Som ett resultat, i detta protokoll beskriver vi ett alternativt, ekonomisk, intern metod som är baserad på den ursprungliga Boom et al. Metod 4, som använder den nukleinsyrabindande egenskaper kiseldioxidpartiklar tillsammans med de anti-nukleas egenskaper guanidiniumtiocyanat .
et al. 5 visas i detalj. Sekvensering av PCR-produkten från den konventionella PCR möjliggör differentiering av genotyper som hör till GI och Gli genogrupper.
Protocol
1. Avföringsprover
- Avföringsprover bör lagras fruset för att bevara RNA. För att göra en 10% fekal suspension, tar cirka 0,1 g tinade avföringsprov och komplettera till 1 ml med PBS.
- Alikvot av 200 pl att undvika upprepad frysning och tining. Lagra alikvoter vid -70 ° C.
- Tina och centrifugera portioner vid 4.000 g under 10 minuter före användning för extraktion.
2. Framställning av silikapartiklar för extraktion med guanidin och kiseldioxid
- Vid RT, suspendera 30 g kiseldioxid och komplett med dH 2 O upp till 250 ml.
- Efter 24 timmars sedimentering, avlägsna 215 ml av supernatanten genom sugning. Lägg dH 2 O upp till 250 ml och upphäva kiseldioxid pelleten genom att skaka.
- Efter ytterligare 24 timmar, avlägsna supernatanten genom sugning, och justera pH hos kiseldioxiden suspensionen till pH 2,0, med användning av saltsyra (HCl). Alikvotera kiseldioxid suspension i glas BotTLE och autoklaven.
3. Beredning av L6 buffert för Extraktion med Guanidine & Silica
- Vid RT, framställa L6-buffert genom upplösning av 60 g av guanidiniumtiocyanat (GuSCN) och 1,3 g Triton X-100 i 50 ml 0,1 M Tris-hydroklorid, pH 6,4, och 11 ml av en 0,2 M EDTA, pH 8,0 lösning.
4. Beredning av L2-buffert för Extraktion med Guanidine & Silica
- Vid RT, framställa L2-buffert genom upplösning av 180 g av guanidiniumtiocyanat (GuSCN) i 150 ml 0,1 M Tris-hydroklorid, pH 6,4.
5. Extraktionsförfarande
- I varje extraktion ett NOV positivt avföringsprov, som positiv kontroll och DEPC behandlat vatten, som negativ kontroll, bör ingå.
- I en mikro-centrifugrör blanda följande; 1 ml buffert L6, 20 ^ il av kiseldioxidpartiklar och tillsätt 200 | il av den 10% fekalextraktet suspension. Skaka snabbt och låt stå i rumstemperatur under 15 min.
- Centrifugera suspensionen vid 6000 g under 10 s och tvätta pelleten med 1 ml av buffert L2 två gånger, följt av två tvättningar med 70% etanol och en gång med aceton. Torka pelleten i en torr värmeblock vid 56 ° C under 5 minuter.
- Hydrat RNA i kiseldioxiden pelleten genom tillsats av 50 pl av RNas-fritt dH 2 0. Tillsätt 1 pl av RNasin, blanda genom att vända röret och inkubera vid 56 ° C under 15 minuter.
- Centrifugera i 3 minuter vid full hastighet i en bordscentrifug och samla 40 | il av supernatanten innehållande RNA.
- Kvantifiera extraherade RNA prover med hjälp NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Sedan lagra vid -70 ° C fram till användning, upp till 6 månader. (Obs: Ett bättre sätt att bevara total RNA intakt är att omvandla det till cDNA).
6. Alternativ Extraktion Använda Commercial RNA QIAamp Viral RNA Kit
Fullständiga instruktioner finns i häftet provhandahâlls med QIAGEN-kit. Kortfattat förfarandet är följande:
- Pipettera 560 | il av buffert AVL innehållande bärar-RNA in i en 1,5 ml-rör och tillsätt 140 | il av 10% avföring suspension. Blandning av puls-virvling i 15 sek. Inkubera vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Lägg till 560 pl av etanol (96-100%) till provet och blanda genom puls-vortexa i 15 sekunder, sedan kort centrifugera.
- Tillämpas 630 | il av denna lösning till en spinnkolonn placerades i en 2 ml provrör. Centrifugera under 1 minut vid 6000 g, sedan placera spinnkolonn till ett rent 2 ml rör.
- Tvätta kolonnen innehållande bundna RNA med 500 pl buffert AW1 och centrifugera vid 6000 g under 1 min. Placera kolumn i en ren 2 ml provröret.
- Tvätta kolonnen med 500 pl buffert AW2 och centrifugera vid full hastighet (20.000 g eller 14.000 rpm) under 3 min.
- Placera spinn kolumn i en ren 1,5 ml mikro-centrifugrör, tillsätt 40 pl DEPC-behandlat vatten och eluera RNA vid full hastighet. Upprepa påce för en slutlig 80 | il av eluerade RNA.
- Kvantifiera extraherade RNA prover med hjälp NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific). Sedan lagra vid -70 ° C fram till användning, upp till 6 månader. (Obs: Ett bättre sätt att bevara total RNA intakt är att omvandla det till cDNA).
7. Detektering av Norovirus i extraherat RNA genom ett steg i realtid-RT-PCR med specifika Taqman Prober
Instrumentet StepOnePlus realtids-PCR System (Applied Biosystems).
Metod
- Torka och rengör alla arbetsytor, pipetter och centrifuger med RNas AWAY att ta bort eventuell RNas föroreningar.
- Pipettera av NOV GI och GII screening huvudmixar enligt tabell 1. Primrar och prober Taqman listas i tabell 2.
- Alikvot 10 | il av lämplig huvudblandning till varje reaktionsrör.
- Tillsätt 5 | il outspädd okänt provRNA, DEPC-behandlat vatten som negativ kontroll, eller Gl respektive Gli positiv kontroll-RNA, till motsvarande reaktionsbrunnar. Alla prover ska köras i två exemplar. Positiva kontroller och standarder med koncentration av 300 ng / l och 500 ng / il respektive lämnades av National calicivirus Laboratory Center for Disease Control and Prevention (CDC).
- Centrifugera reaktionsplattan vid 6000 g under 10 sek.
- I experimentet egenskaper skärmen, definiera och välj en typ av experiment för körningen. Se TaqMan reagenser visas som reagens typ, och att Pre-PCR läsa och förstärkning väljs.
- Springa 15 pl reaktioner med användning av den termiska profilen i tabell 3.
- Analysera resultaten.
8. Genotypning av NOV GI och GII använda konventionell RT-PCR och sekvensering
(Det är inte nämns i denna video eftersom det är ett vanligt och allmänt använd metod.)
Instrument. Applied Biosystems StepOne och StepOnePlus Real Time PCR System med Quantitec mallen.
Metod
- Före genotypning är det gengrupp (GI eller Gli) av proverna bestämdes genom screening RT-PCR som beskrivits ovan. GI NOV RNA måste förstärkas med GI genotypning Master Mix och GII NOV RNA med GII genotypning Master Mix.
- Pipettera av NOV GI och GII genotypning huvudmixar enligt tabell 4. Primrar GI SKF / SKR-och G2 SKF / SKR listas i tabell 5.
- Alikvot 45 | il av den lämpliga huvudblandning till 0,2-ml reaktionsbetingelser.
- Tillsätt 5 | il DEPC-behandlat vatten till varje negativ kontroll rör, och 5 | il av pre-skärmad, Nov (GI och / eller Gli) positiva RNA till den motsvarande reaktionsröret.
- Springa 50 pl reaktioner med användning av den termiska profilen i tabell 6.
- Sända PCR-produkter contaiNing åtminstone 100 ng / | il av den amplifierade regionen kapsiden till Macrogen Company för rening och sekvensbestämning. (9700 Stora Seneca Hwy. Rockville, MD 20.850 och $ 10 per prov per sekvensering).
9. Representativa resultat
Figur 1 visar representativa resultat från Taqman One-Step RT-PCR vid användning för att analysera RNA extraherat från avföringsprover från diarrésjukdomar barn. Tröskeln cykeln (Ct) för ett positivt prov var satt till mindre än eller lika med Ct 37 för GI och Ct 39 för GII. De CT-värdena för de positiva kontrollerna visade sig vara mindre än 27 och 18 i ORF1-ORF2 knutpunkt för GI och GII, respektive. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2
| Master Mix | Slutlig konc | Volym (^ il) |
| H 2 0 PCR | 2,875 | |
| Quantitect RT-PCR Master Mix | 1x | 6,250 |
| RT Blanda | 1x | 0,125 |
| 50 M Cog R primer | 1 pM | 0,250 |
| 50 M Cog F primer | 1iM | 0,250 |
| 10 | iM ring sond | 1 pM | 0.125/0.250 * |
| 10,00 |
* 0,250 | il av varje prob användes för GI testning, medan 0,125 | il av varje prob användes för Gli testning.
Tabell 1. Qiagen Quantitect Master Mix för screening GI och GII (Trujillo et al., 2006). 7
| Namn | Geno-grupp | Använda | Sekvens (5 'till 3') |
| Cog 1R | GI | Primer | CTT AGA CGC Cat CAT TYA C |
| Cog 1F | GI | Primer | CGY TGG ATG CGN TTY CAT GA |
| Cog 2R | Gli | Primer | TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA |
| Cog 2F | Gli | Primer | CAR GAR BCN ATG TTY AGR TGG ATG AG |
| Ring 1A | GI | Sond | FAM-AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring 1B | GI | Sond | FAM-AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA-BHQ-1 |
| Ring2-TP | Gli | Sond | FAM-TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT-BHQ-1 |
Tabell 2. Primer och oligonukleotider sond som används för real-time kvantitativ RT-PCR för genogrupper I, II (Kageyama et al.2003). 8
| Steg | Temp (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 50 | 30:00 | cDNA-syntes |
| 2 | 95 | 15:00 | Hotstart Taq-polymeras aktivering |
| 3 | 95 | 00:15 | |
| 60 | 01:00 | 45x cykler |
TABELL3. Termisk profil för ett steg Taqman Realtids RT-PCR (Trujillo et al., 2006). 7
| Master Mix | Slutlig konc | Volym (^ il) |
| H 2 0 PCR | 29,50 | |
| 5X Qiagen RT-PCR-buffert | 1x | 10,00 |
| 10 mM dNTP-blandning | 0,4 mM | 2,00 |
| Enzymblandning | 2,00 | |
| 40 U / ^ il RNAsin | 20 U / ^ il | 0,50 |
| 10 | iM SKF | 0,1 | iM | 0,50 |
| 10 | iM SKR | 0,1 | iM | 0,50 |
| 45,00 |
Tabell 4. Qiagen One-Step RT-PCR Master mix för genotypning GI och GII.
| Namn | Geno-grupp | Använda | Sekvens (5 'till 3') |
| G1SKF | GI | Primer | 5'-CTG CCC GAA TTY GTA AAT GA - 3 |
| G1SKR | GI | Primer | 5'-CCA ACC CAR CCA TTR TAC A - '3 |
| G2SKF | Gli | Primer | 5'-CNT GGG AGG GCG ATC GCA A - 3 |
| G2SKR | Gli | Primer | 5'-CCR CCN GCA TRH CCR TTR TA CAT-3 |
Tabell 5. Primrar som används för amplifiering av regionen C i kapsid-regionen (Kojima et al., 2002). 5
| Steg | Temp (° C) | Tid (min) | |
| 1 | 60 | 30:00 | cDNA-syntes |
| 2 | 96 | 15:00 | Hotstart Taq-polymeras aktivering |
| 3 | 94 | 00:030 | |
| 52 | 01:00 | 40X cykler | |
| 72 | 00:30 | ||
| 4 | 72 | 10:00 | Glödgning |
Tabell 6. Termisk profil för Taqman One-Step RT-PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med användning av ekonomiska intern metod för isolering av nukleinsyra från avföringsprover, vi erhålla samma resultat som med kommersiella QIAmp virala RNA-kit från Qiagen, och tillsammans med TaqMan RT-PCR utvecklades i vårt laboratorium har vi kan detektera ett brett spektrum av NOV genotyper som hör till GI och GII gengrupp. En nyligen utkommen publikation av regionen C-protokollet rapporterade genotypning andelen 78% 6. Eftersom mångfald samtida nov stammarna har ökat under tidigare år kommer andelen framgångsrika beror på olikheter i primers i region C för exemplar som testas. Analysen är användbar för rutinmässig diagnostisk eftersom den avlägsnar efter amplifieringsprodukt bearbetning, vilket förkortar omloppstid 7. Bortsett från diagnos kan detta protokoll också användas för att klargöra epidemiologi nov infektioner, vilket är användbart för folkhälsan kontroll av denna sjukdom.
När du kör screening RT-PCR negativa kontrollen (NC) reaktioner för primer / prob uppsättningar bör inte uppvisa fluorescens tillväxtkurvor som korsar tröskeln linje. Om ett falskt positivt sker med en eller flera av primer / prob Sets NC reaktioner, kan provkontaminering har inträffat, och i alla sådana fall, var hela körningen ogiltigförklaras och upprepas med strängare efterlevnad av riktlinjerna.
Korsa reaktion för screening RT-PCR testades med hjälp av GI och GII positiva standarder från CDC. Ingen korsreaktion iakttogs mellan GI primrar och prober med Gli RNA och omvänt. Reproducerbarheten av genomgången RT-PCR var hög som Ct-värden där liknande för upprepade körningar med RNA från de positiva kontrollerna. RNA från barn avföringsprov som hade hittats positivt för nov och hade CT-värden mellan 20 och 33, där sedan förstärks av den konventionella RT-PCR och skickas för genotypning. Fem positiva prover med CT-värden mellan 35 och 38 var riktade för sekventielltsiering som den virala belastningen där befunnits vara för lågt för efterföljande amplifiering med användning av konventionella RT-PCR.
För närvarande är tillgången på norovirus diagnosen begränsad eftersom de metoder som inte kan genomföras i lokala laboratorier med endast grundläggande utrustning. Det här fördröjer diagnos och behandling i enskilda diarré fall eller utbrott. Satsen metod är pålitlig och snabb men kräver en betydande mängd tid och resurser för att transportera material till länder. Kostnaden är tre gånger så vår metod. Vi har visat en extra metod att använda lätt-tillgängliga i land reagenser för detektion av NOV som är lika enkel, snabb och tillförlitlig. Denna kostnad-effektiv metod förbi beroendet som köps utomlands, problemen med internationella och inom nationella bestämmelser om transporten som slutligen leder till en tillgänglig diagnos och snabb behandling av en av de vanligaste virala orsakerna gastroenterit i children.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna vill tacka National Center calicivirus Laboratory for Disease Control and Prevention (CDC) för den typ gåva av en standard och kontroll positiva i nov och laboratorier School of Public Health vid Johns Hopkins för att ge reagensen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Guanidine isothiocyanate | Sigma-Adrich | G9277 | |
| Tris HCL | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Silica | Sigma-Aldrich | S5631 | |
| Triton X 100 | VWR | 14530 | |
| Diethylpyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 | |
| QIAamp viral RNA Mini Kit (250) | Qiagen | 52906 | |
| QuantiTec Probe RT-PCR kit (200) | Qiagen | 204443 | |
| Qiagen One Step RT-PCR Kit (200) | Qiagen | 210212 | |
| Rnase Inhibitor 2000 units | A. Biosystems | N808-0119 | 2000 unids/vial |
| Non-Stick Rnae-free Microfuge Tubes | Ambion | AM12450 | |
| UltraPure Agarose 1000 | Invitrogen | 16550-100 |
References
- Medici, M. Molecular epidemiology of Norovirus infections in sporadic cases of viral gastroenteritis among children in Northern Italy. L. Medical Virology. 78, (2006).
- Vidal, R. Novel recombinant Norovirus causing outbreaks of gastroenteritis in Santiago, Chile. J. Clinica Microbiology. 4, (2006).
- Xavier, M. Detection of caliciviruses associated with acute infantile gastroenteritis in Salvador, an urban center in Northeast Brazil. Braz. J. Med. Biol. Res. 42, (2009).
- Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).
- Kojima, S. Genogroup-specific PCR primers for detection of Norwalk-like viruses. J. Virol. Methods. 100, 107-114 (2002).
- Mattison, K. Multicenter comparison of two norovirus ORF2-based genotyping protocols. J. Clin. Microbiol. 47, 3927-3932 (2009).
- Trujillo, A. A. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of norovirus. J. Clin. Microbiol. 44, 1405-1412 (2006).
- Kageyama, T. A broadly reactive and highly sensitive assay for Norwalk-like viruses on real-time quantitative RT-PCR. J. Clin. Microbiol. 41, 1548-1557 (2003).
