هذا البروتوكول توضح كيفية قياس المغنيسيوم (II) التي تعتمد على تشكيل بنية الحمض النووي الريبي العالي من قبل اثنين من أساليب footprinting الهيدروكسيل.
جزيئات الحمض النووي الريبي تلعب دورا أساسيا في علم الأحياء. بالإضافة إلى نقل المعلومات الوراثية ، يمكن أن الحمض النووي الريبي أضعاف في هياكل التعليم العالي دورا فريدا الوفاء بيولوجية محددة على النحو الموثق ، منظم أو المحفز. معلومات حول تكوين الاتصال العالي ضروري لفهم وظيفة من جزيئات الحمض النووي الريبي. جذور الهيدروكسيل (OH •) هي تحقيقات فريد هيكل الأحماض النووية بسبب التفاعلات عالية وحجم صغير. 1 عندما تستخدم على النحو التحقيق footprinting ، جذور الهيدروكسيل خريطة سطح المذيب يمكن الوصول إليها في العمود الفقري phosphodiester من الحمض النووي الريبي (1) و2 مع غرامة مثل القرار النوكليوتيدات واحد. ويمكن استخدام footprinting الهيدروكسيل لتحديد النيوكليوتيدات داخل سطح التماس بين الجزيئات ، مثل الحمض النووي في البروتين (1) والجيش الملكي النيبالي المجمعات البروتين. ويمكن تحديد التوازن 3 و 4 التحولات الحركية من خلال إجراء footprinting الهيدروكسيل كدالة لsolutiعلى المتغير أو الوقت ، على التوالي. ومن السمات الرئيسية لfootprinting هو أن تقتصر على التعرض لجنة التحقيق (على سبيل المثال ، "واحد من الزلزال حركية') في نتائج موحدة لأخذ العينات من كل من البوليمر النوكليوتيدات 5
في هذه المقالة الفيديو ، ونحن نستخدم المجال P4 – P6 من ribozyme رباعية لتوضيح RNA إعداد وتصميم عينة من الأيسوثرم (II) بوساطة المغنيسيوم للطي. نحن تصف استخدام معروفة الهيدروكسيل بروتوكول footprinting جذرية تتطلب H 2 O 2 (نحن نسمي هذا "peroxidative' البروتوكول) ، وقيمة ، ولكن ليس معروفا على نطاق واسع ، وهذا البديل يا المنحل يستخدم بشكل طبيعي 2 (نحن نسمي هذا "لل التأكسدي 'البروتوكول). ويقدم لمحة عامة عن تقليص البيانات وتحويلها وإجراءات التحليل.
footprinting الهيدروكسيل هو أداة قيمة لتقييم المذيب مساحة يمكن الوصول إليها من الأحماض النووية. يمكن أن يتبع تشكيل النوعي والكمي لهيكل التعليم العالي 14 بوصفها وظيفة من المعلمات مثل نوع وتركيز أيون ، ودرجة الحموضة ، درجة الحرارة ، والبروتينات ملزمة أو قابلة للطي الع?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل عن طريق المنح المقدمة من المعهد الوطني للصحة RO1 – GM085130 والمؤسسة الوطنية للعلوم MCB0929394. نشكر الدكتور ماريون شميت لضيافتها وعلى السماح لنا الفيلم في مختبرها.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |