פרוטוקול זה מתאר כיצד לכמת את Mg (II) תלויי היווצרות של RNA מבנה שלישוני על ידי שתי שיטות footprinting רדיקלי הידרוקסיל.
מולקולות רנ"א תפקיד חיוני בביולוגיה. בנוסף להעברת המידע הגנטי, RNA יכול להתקפל למבנה שלישוני ייחודי למלא תפקיד ביולוגיים ספציפיים כמו קלסר הרגולטור, או זרז. מידע על היווצרות קשר שלישוני הכרחי להבין את הפונקציה של מולקולות RNA. רדיקלים הידרוקסיל (OH •) הן בדיקות ייחודי של המבנה של חומצות גרעין בשל תגובתיות גבוהה שלהם בגודל קטן. 1 כאשר שימש בדיקה footprinting, רדיקלים הידרוקסיל למפות את פני השטח נגיש ממס של עמוד השדרה phosphodiester של ה-DNA ו-RNA 1 עם 2 קנס כמו רזולוציה נוקלאוטיד בודד. Footprinting רדיקלי הידרוקסיל יכול לשמש כדי לזהות את נוקלאוטידים בתוך משטח מגע מולקולאריים, למשל חלבון-DNA ו-RNA-1 חלבון קומפלקסים. שיווי משקל 3 ו 4 מעברים הקינטית ניתן לקבוע על ידי ביצוע footprinting רדיקלי הידרוקסיל כפונקציה של solutiעל משתנים או זמן, בהתאמה. תכונה מרכזית של footprinting היא כי חשיפה מוגבלת בדיקה (למשל, "יחיד פגע קינטיקה ') תוצאות דגימה אחידה של כל נוקלאוטיד של הפולימר. 5
במאמר זה וידאו, אנו משתמשים תחום P4-P6 של ribozyme Tetrahymena כדי להמחיש הכנה RNA מדגם וקביעת (II) בתיווך איזותרמות Mg מתקפלים. אנו מתארים את השימוש בפרוטוקול footprinting הידרוקסיל ידוע קיצוני הדורש H 2 O 2 (שאנו מכנים זה את פרוטוקול "peroxidative") לבין בעל ערך, אך לא ידוע, חלופה המשתמשת O טבעי מומס 2 (אנחנו קוראים לזה ' חמצוני "פרוטוקול). סקירה כללית של צמצום הנתונים, שינוי נהלים ניתוח מוצג.
Footprinting רדיקלי הידרוקסיל היא כלי רב ערך כדי להעריך את אזור ממס משטח נגיש של חומצות גרעין. היווצרות איכותי וכמותי של מבנה שלישוני 14 ניתן בעקבות כפונקציה של פרמטרים כגון סוג הריכוז יונים, pH, טמפרטורה, או קיפול חלבונים מחייב שיתוף גורמים. שילוב מרתק של פרוטוקול קדימ…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות RO1-GM085130 ואת הקרן הלאומית למדע MCB0929394. אנו מודים לד"ר שמידט מריון על האירוח שלה עבור ומאפשר לנו הסרט במעבדה שלה.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |