이 프로토콜은 MG (II) – 종속 히드록실 급진 footprinting 두 가지 방법으로 RNA 차 구조 형성을 계량하는 방법을 설명합니다.
RNA의 분자 생물학에서 필수적인 역할을한다. 유전 정보를 전달하는 이외에, RNA는 레귤레이터, 바인더 또는 촉매와 같은 특정 생물 학적 역할을 수행 고유한 삼차 구조로 접을 수 있습니다. 차 접촉 형성에 관한 정보는 RNA 분자의 기능을 이해하는 것이 필수적입니다. 히드록실 래디 칼 (• OH)가 높은 반응과 작은 크기로 인해 핵산의 구조 독특한 프로브입니다. 1 footprinting 프로브로 사용하면, 히드록실 래디 칼과 함께 DNA 1과 RNA 2의 phosphodiester 백본의 용매 접근 표면을지도 단일 뉴클레오 티드 해상도만큼 괜찮아요. 히드록실 라디칼 footprinting는 DNA – 단백질 1과 RNA – 단백질 단지의 예 분자간 접촉면 내에 세포핵을 식별하는 데 사용할 수 있습니다. 평형 3 번과 4 번 전환 운동은 soluti의 함수로 수산기 라디칼 footprinting을 실시하여 확인할 수 있습니다에서 변수 또는 시간을 각각. footprinting의 주요 기능은 프로브에게 노출 제한 (예 : '싱글 히트 속도론') 폴리머의 각 염기의 유니폼을 샘플링 결과입니다 5.
이 비디오 문서에서, 우리는 RNA 샘플의 준비와 MG (II) – 중재 접는 등온선의 결정을 설명하기 Tetrahymena ribozyme의 P4 – P6 도메인을 사용합니다. 우리는 H 2 O 2 (우리가이 'peroxidative'프로토콜 호출)와 자연스럽게 녹아 O 2를 사용하는 귀중한하지만, 널리 알려진 아니라, 대안을 (우리가 부르는 '가 필요합니다 잘 알려진 수산기 라디칼 footprinting 프로토콜의 사용을 설명 산화 '프로토콜). 데이터 감소, 변환 및 분석 절차의 개요가 제공됩니다.
히드록실 급진 footprinting는 핵산의 용매 접근 표면적을 평가하는 유용한 도구입니다. 차 구조 14 질적 및 양적 형성은 이러한 이온 종류와 농도, 산도, 온도, 바인딩 단백질이나 접는 공동 요인으로 매개 변수의 함수로 다음 수 있습니다. 정직하고 저렴한 프로토콜과 그 결과 용매 접근성 및 단일 뉴클레오 티드 수준에서 접는 정보의 강력한 조합이 방법은 매우 매력적합니다. 전통적 • OH?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 건강 RO1 – GM085130 국립 연구소와 국립 과학 재단 (National Science Foundation) MCB0929394에서 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 그녀의 환대와 그녀의 실험실에서 영화 우리에게 허용에 대한 박사 메리언 슈미트 감사합니다.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |