Este protocolo descreve como quantificar o Mg (II) dependente da formação de RNA estrutura terciária através de dois métodos de pegada radical hidroxila.
Moléculas de RNA desempenham um papel essencial na biologia. Além de transmitir a informação genética, RNA pode dobrar em exclusivo estruturas terciárias cumprindo um papel biológico específico como ligante regulador, ou catalisador. Informações sobre a formação de contato superior é essencial para compreender a função das moléculas de RNA. Radicais hidroxila (OH •) são sondas única da estrutura dos ácidos nucléicos, devido à sua alta reatividade e tamanho pequeno. 1 Quando utilizado como uma sonda pegada, os radicais hidroxila mapa da superfície acessível solvente do backbone fosfodiéster do DNA e RNA 1 2 com tão fina como a resolução de nucleotídeo único. Footprinting radical hidroxila pode ser usado para identificar os nucleotídeos dentro de uma superfície de contato intermolecular, por exemplo, DNA-proteína-1 e RNA-proteína complexos. Equilibrium 3 e 4 transições cinética pode ser determinada através da realização de pegada radical hidroxila em função de um solutina variável ou tempo, respectivamente. Uma característica fundamental da pegada é que a exposição limitada à sonda (por exemplo, 'single-hit cinética ") resulta na amostragem uniforme de cada nucleotídeo do polímero. 5
Neste artigo de vídeo, usamos o domínio P4-P6 da ribozima Tetrahymena para ilustrar RNA preparação de amostras e determinação de um (II) mediada por Mg isotermas de dobradura. Descrevemos a utilização do protocolo pegada bem conhecido radical hidroxila que requer H 2 O 2 (nós chamamos este protocolo "peroxidativo ') e um valor, mas não muito conhecido alternativa, que usa naturalmente O 2 dissolvido (chamamos isso de" o protocolo oxidativo "). Uma visão geral da redução de dados, transformação e procedimentos de análise é apresentado.
Footprinting radical hidroxila é uma ferramenta valiosa para avaliar a área de superfície acessível solvente de ácidos nucléicos. Formação qualitativa e quantitativa da estrutura terciária 14 pode ser seguido em função de parâmetros como tipo e concentração de íons, pH, temperatura, proteínas de ligação ou dobrar co-fatores. A combinação irresistível de um protocolo para a frente e de baixo custo e acessibilidade resultante de solvente e informações dobrar em um nível de nucleotídeo ?…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado por doações do Instituto Nacional de Saúde RO1-GM085130 e National Science Foundation MCB0929394. Agradecemos ao Dr. Marion Schmidt por sua hospitalidade e por nos permitir filme em seu laboratório.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |