Этот протокол описывает, как количественного Mg (II)-зависимой РНК формирование третичной структуры двумя методами гидроксильных радикалов footprinting.
Молекулы РНК играют важную роль в биологии. В дополнение к передаче генетической информации, РНК может спасовать в уникальной третичной структуры выполняют особую роль в качестве регулятора биологических, связующее или катализатор. Информация о третичном образовании контакта необходимо понимать функции молекул РНК. Гидроксильных радикалов (OH •) представляют собой уникальные зонды структуры нуклеиновых кислот из-за их высокой реакционной способностью и небольшим размером. 1 При использовании в качестве footprinting зонд, гидроксильные радикалы карте растворителя доступной поверхности фосфодиэфирных основа ДНК и РНК 1 2 с тонкая, как одиночных нуклеотидных разрешения. Гидроксильных радикалов footprinting может быть использована для идентификации нуклеотидов в межмолекулярных контактной поверхности, например, в ДНК-белковых 1 и РНК-белковых комплексов. Равновесие 3 и 4 кинетические переходы могут быть определены путем проведения гидроксильных радикалов footprinting в зависимости от solutiна переменную или времени, соответственно. Ключевой особенностью является то, что footprinting ограниченным воздействием зонда (например, "одним хитом кинетика ') приводит к равномерной выборке каждый нуклеотид полимера 5.
В этом видео статье мы используем P4-P6 области Tetrahymena рибозим, чтобы проиллюстрировать РНК подготовки проб и определения Mg (II)-опосредованной складной изотерм. Мы описываем использование известных гидроксильных радикалов протокол, который требует footprinting H 2 O 2 (мы называем это "peroxidative" протокол) и ценную, но не очень широко известно, альтернатива, которая использует естественно растворенного O 2 (мы называем это ' окислительный "протокол). Обзор обработки данных, трансформация и анализ процедур представлена.
Гидроксильных радикалов footprinting является ценным инструментом для оценки растворителя доступной площади поверхности нуклеиновых кислот. Качественный и количественный формирование третичной структуры 14 можно проследить как функцию параметров, таких как ион типа и концентрации,…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Национального института здоровья RO1-GM085130 и Национальный научный фонд MCB0929394. Мы благодарим доктора Марион Шмидт за гостеприимство и за предоставленную нам возможность фильма в своей лаборатории.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |