Summary
Wir haben ein Protokoll zur Induktion von Neuroblasten direkt von pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen unter bestimmten Bedingungen mit kleinen Molekülen, die Ableitung von einem großen Angebot an humanen neuronalen Vorläuferzellen und neuronalen Zelltypen in sich entwickelnden ZNS für neuronale Reparatur ermöglicht gepflegt eingerichtet.
Abstract
Es gibt einen großen unerfüllten Bedarf an einer klinisch-geeigneten menschlichen Nervenzellen Quelle für die Reparatur oder Regeneration des geschädigten zentralen Nervensystems (ZNS) Struktur und Schaltungen in der heutigen Healthcare-Industrie. Zell-basierte Therapien vielversprechend, um die verlorenen Nervengewebe und Funktion für ZNS-Störungen wiederherzustellen. Allerdings haben Zelltherapien auf ZNS-derived neuralen Stammzellen Supply Einschränkung und Schwierigkeit, im klinischen Umfeld aufgrund ihrer begrenzten Expansion in Kultur und mangels Plastizität nach umfangreichen Passage 1-3 anzutreffen sind. Trotz einiger positiven Ergebnisse, werden die ZNS-derived menschliche neurale Stammzellen (hNSCs), um ihre therapeutische Wirkung vor allem durch ihre nicht-neuronalen Nachkommen ausüben durch die Herstellung von trophischen und neuroprotektive Moleküle zur Rettung des körpereigenen Zellen 1-3. Alternativ pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen (hES) anbieten Heilmittel für eine Vielzahl von neurologischen Erkrankungen, die durch supplying die Vielfalt der menschlichen neuronalen Zelltypen im ZNS für die Regeneration 1,4-7. Allerdings hat, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten hES effizient und vorhersagbar Kanal zu einem gewünschten Phänotyp eine große Herausforderung sowohl für Entwicklungs-Studie und klinische Übersetzung worden. Herkömmliche Ansätze beruhen auf multi-lineage Neigung von pluripotenten Zellen durch spontane Keimblatt Differenzierung, was ineffizient und unkontrollierbare Linie-Engagement, das oft durch phänotypische Heterogenität und Instabilität, damit ein hohes Risiko für Tumorigenität 7-10 gefolgt. Darüber hinaus können ausländische undefined / Tier biologische Zusatzstoffe und / oder Anleger, die typischerweise für die Isolierung, Expansion und Differenzierung von hES verwendet wurden um direkte Verwendung solcher Zellen spezialisiert Transplantaten in Patienten problematisch 11-13. Um diese Hindernisse zu überwinden, haben wir die Elemente einer definierten Kultur-System gelöst notwendig und ausreichend für sustaining Epiblast Pluripotenz von hES und dient als Plattform für die de novo Ableitung von klinisch-geeignet hESCs und effektiv leiten wie hESCs gleichmäßig in Richtung klinisch relevanter Linien durch kleine Moleküle 14 (siehe schematischer in Abb. 1).. Retinsäure (RA) nicht induziert neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES am Anleger 1, 14 gehalten. Und im Gegensatz zu Maus ES-Zellen, die Behandlung hESC differenzierte Embryoidkörpern (EVG) nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Doch nach Screening einer Vielzahl von kleinen Molekülen und Wachstumsfaktoren, fanden wir, dass solche definierten Bedingungen Retinsäure (RA) ausreichen, um die Spezifikation von Neuroektoderms direkt aus pluripotenten hES, die weiter zu Neuroblasten, dass menschliche neuronale Vorläuferzellen und Neuronen in der generierten fortgeschritten induzieren gemacht ZNS mit hohem Wirkungsgrad (Abb. 2). Wir definierten Bedingungen für die Induktion von neuroBlasten direkt aus pluripotenten hES ohne Zwischenschaltung einer multi-lineage Embryoidkörper Bühne, so dass gut kontrollierte effiziente Ableitung der einen großen Vorrat an menschlichen Nervenzellen im gesamten Spektrum der Entwicklungsstadien für die Zell-basierter Therapeutika.
Protocol
1. Lösungs-und Medien-Vorbereitung
- Gelatin Beschichtungslösung: 0,1% (w / v) Gelatine in ddH 2 O, autoklaviert und bei 4 ° C.
- Matrigel Beschichtungslösungen. Stammlösung: langsam auftauen Matrigel (10 ml) bei 4 ° C über Nacht, 10 ml eiskaltem DMEM oder DMEM/F12, gut mischen und aliquoten 1 ml / Rohr unter sterilisiert Gewebekultur Kapuze, lagern bei -20 ° C. Working-Lösung: langsam auftauen 1 ml Matrigel Aliquot bei 4 ° C für 1-2 Stunden, Transfer zum 14 ml gekühltes DMEM oder DMEM/F12 und gut mischen unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung.
- Menschliche Laminin Beschichtungslösung: Verdünnen Sie 1 ml menschlichen Laminin-Lösung (0,5 mg / ml in Tris Buffered NaCl, Lagerung bei -80 ° C, langsam auftauen bei 4 ° C für 1-2 Stunden) mit eiskaltem DMEM oder DMEM/F12 zu 12,5 ml Arbeitslösung (40 ug / ml) unter sterilisiert Gewebekultur Haube unmittelbar vor der Beschichtung.
- Wachstumsfaktor Stammlösungen (500-1000X): Man löst growth factor bei 10 ug/ Ml in sterilisierte Puffer (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, 10% Glycerin, 1XPBS) und speichern als 50-100 &mgr; l / Röhrchen aliquotiert bei -80 ° C.
- All-trans-Retinsäure Arbeitslösung (1000X): 10 mM in DMSO, speichern in Aliquots bei -80 ° C.
- HESC Medien: DMEM/F12 oder KO-DMEM (80%), KO Serumersatz (20%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MEM nicht essentielle Aminosäuren (MNAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C mit 20 ng / ml bFGF vor der Verwendung ergänzt. Oder ersetzen Sie "knock out (KO) Serum-Ersatz" mit definierten Komponenten: DMEM/F12 oder KO-DMEM (100%), L-Alanyl-L-Gln oder L-Gln (2 mM), MNAA (1X), MEM wesentliche Aminosäuren (MEAA, 1X) und β-Mercaptoethanol (100 uM), filtriert und bei 4 ° C, mit bFGF (20 ng / ml), Insulin (20 ug / ml), Ascorbinsäure (50 ug / ergänzt ml), Human Aktivin A (50 ng / ml), Humanalbumin / Albumax (10 mg / ml), und menschliches Transferrin (8 pg / ml) vor der Verwendung.
- NSC Medien: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), Heparin (8 pg / ml).
2. Plattenbeschichtung
- Coat-Platten mit Gelatine: 2,5 ml / well der Gelatine-Lösung bis 6-Well-Platten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C befeuchteten Inkubator.
- Coat-Platten mit Laminin: chill Gelatine beschichteten Platten und entfernen Gelatine, 2,5 ml / well Matrigel oder menschliche Laminin-Beschichtung funktionierende Lösung zu vorgekühlte verkleistert 6-Well-Platten und Inkubation bei 4 ° C über Nacht.
3. Passagieren und Seeding Undifferenzierte hESCs unter definierten Bedingungen
- Lassen hESC Kolonien wachsen auf 5-7 Tage alt, und nehmen Sie hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze.
- Wählen Sie hESC Kolonien aufgeteilt werden. Morphologisch sind diese Kolonien> 75% undifferenzierte hES (kleine kompakte Zellen), in der Regel leicht opake (nicht weißen aufgehäuften Zellen nicht klar differenzierten Zellen) mit definierten Rand un habenderneath dem Binokular. Vorsichtig einen Überblick über die ausgewählten Kolonien und entfernen differenzierten Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie und alle differenzierten Teile (falls vorhanden) der Kolonie mit der Schärfe des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare. (Bitte beachten Sie, pluripotenten hES auf eine vorübergehende Phase, eine spontane Differenzierung selbst unter optimalen Bedingungen, obwohl bevorzugt, es schwierig festzustellen, Thesen Zellen sind 100% undifferenzierte unter Binokular,> 75% undifferenziert sind in der Regel als der Pass Punkt betrachtet. Die differenzierten Zellen in der Regel nicht Samen und weiter wachsen, beseitigt in der Passage-Prozess)
- Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende differenzierten Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF.
- Schneiden Sie die undifferenzierte hES-Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare.
- Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und Pool zusammen.
- Saugen Sie das Matrigel oder menschliche Laminin-Lösung von dem beschichteten frischen Platten. Aliquot 4 ml / well hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-Well-Platte. Gently Transfer der Platte Inkubator ohne Schütteln und lassen Kolonie Stücke Samen über Nacht, ohne zu stören in einem befeuchteten 37 ° C Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2.
4. Neuronale Induktion von hESCs unter definierten Kultur-System mit Retinsäure
- Am Tag 3 nach der Aussaat, die Abschaffung der meisten alten Medien aus jedem Well der Platte und lassen genug Medien zu ermöglichen hESC Kolonien unter Wasser (niemals zulassen hESCs austrocknen) werden. Ersetzen mit 4 ml / well frisches hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und 10 uM Retinsäure.
- Ersetzen Sie die alten Medien mit frischen hESC Medien mit 20 ng / ml bFGF und10 uM Retinsäure jeden zweiten Tag, und lassen neural-induzierten embryonalen Stammzellen Kolonien wachsen zu Tag 7 oder 8. Alle Zellen innerhalb der Kolonie zu unterziehen Morphologie Änderungen an großen differenzierten Zellen, die auch weiterhin vermehren wird. Die Kolonien werden in der Größe zu erhöhen, um die Platte am Tag 7 oder 8 abdecken, und die Zellen beginnen, häufen sich in einigen Gebieten der Kolonien.
5. Continuing Neuronale Differenzierung in Suspensionskultur
- Nehmen hESC Kultur Platte Präpariermikroskop (pre-warm Sezieren der Bühne bis 37 ° C) unter Sezieren sterilisiert Kapuze. Vorsichtig einen Überblick über die Kolonien und entfernen Fibroblasten-Schicht rund um die Kolonie (differenzierte Zellen aus der Kolonie eingewandert) mit dem Rand des P2 sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare.
- Entfernen Sie die alten Medien mit schwimmenden freistehende Fibroblasten-Zellen durch Absaugen. Waschen mit hESC Medien (ohne bFGF) einmal. 3 ml / well frisches hESC Medien (ohne bFGF).
- Schneiden Sie die neural-induced hESC Kolonien in kleine Stücke, und lösen Sie mit einer sterilen Pipettenspitze gezogen oder Glaskapillare.
- Pool der Medien, die losgelöst Kolonie Stücke zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Waschen Sie die Platte einmal mit 1 ml / well hESC Medien (ohne bFGF) und Pool zusammen.
- Aliquot 4 ml / well serumfreiem hESC Medien mit Kolonie Stücke zu einer 6-well ultraniedrigen Befestigungsplatte und inkubieren bei 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit schwimmende zellulären Clustern (Neuroblasten) für 4-5 Tage zu bilden.
6. Neuronalen Phänotyp Reifung in Adhesive Kultur
- Pool der Medien mit schwimmenden Neuroblasten zusammen in einem 50 ml konischen Röhrchen. Zentrifugation bei 1400 rpm für 5 min. Saugen Sie die alten Medien so viel wie du kannst, und fügen Sie die gleiche Menge frischen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml).
- Pipette auf und ab zu schweben Neuroblasten und aliquoten 4 ml / well bis 6-Well-Platten mischen. Die Neuroblasten können auch an sich seineded in einem Laminin / Kollagen (Matrigel) oder menschliche Laminin polymerisiert 3-dimensionale Matrix in serum-freien NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) . Übertragen Sie die Platten auf eine 37 ° C befeuchteten Inkubator, damit Neuroblasten zu befestigen Nacht.
- Ersetzen NSC Medien mit VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml) und BDNF (10 ng / ml) jeden zweiten Tag. Umfangreiche Netzwerke von Neuriten tragenden neuronalen Zellen und pigmentierten Zellen beginnen, innerhalb von 2 Wochen kontinuierlichen Kultivierung und Erhöhung der Zahl mit der Zeit auftreten, und könnten für über 3 Monate aufrechterhalten werden.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Retinsäure (RA) dargestellt wird ausreichen, um hESCs in den definierten Kultur-System zum Übergang erhalten von Pluripotenz ausschließlich auf eine neuroektodermalen Phänotyp (Abb. 2A) zu induzieren. Bei der Belichtung von undifferenzierten hES zu RA werden alle Zellen innerhalb des Koloniemorphologie Veränderungen zu unterziehengroßen differenzierten Zellen, die zum Ausdruck Pluripotenz-assoziierter Marker nicht mehr, wie durch Oct-4, und beginnen Ausdruck verschiedener Neuroektoderms-assoziierte Marker wie HNK1, AP2, und TrkC (Abb. 2B). Diese großen differenzierten Zellen wird auch weiterhin zu vermehren und die Kolonien an Größe zunehmen, ausgehend spontan auf den frühen neuronalen Marker β-III-Tubulin (Abb. 2B) auszudrücken. Die reiferen neuronalen Marker MAP-2 beginnen, in den Gebieten der Kolonien, in denen Zellen auf (Abb. 2B) angehäuft haben scheinen. Gleichzeitig mit dem Erscheinen der neuroektodermalen Zellen und neuronalen Differenzierung wird die neuronale spezifische Transkriptionsfaktor Nurr1, in dopaminergen neuronalen Differenzierung und Aktivierung der Tyrosin-Hydroxylase (TH) Gen 16 verwickelt, in den Zellkern (Abb. 2B) zu verlagern. Nach losgelöst, wird der RA-Behandlung hESCs schwimmenden zellulären Clustern (Neuroblasten) in einer Suspension Kult Formure auf die neuronale Differenzierung fortzusetzen. Nach dem Entfernen von bFGF und nach erlaubt die Neuroblasten zu einer Gewebekultur Platte oder in einem Laminin / Kollagen polymerisiert 3-dimensionale Matrix in einem serumfreien Medium definiert, β-III-Tubulin-und Map-2-Expression, Neuriten ausgesät legen -tragenden Zellen und pigmentierten Zellen werden beginnen, mit einer drastischen Steigerung der Effizienz als die spontane multi-lineage Differenzierung von hES ohne Behandlung über den gleichen Zeitraum im Vergleich erscheinen und könnte für mehr als 3 Monate (Abb. 2C) aufrechterhalten werden.
Abbildung 1 Eine schematische Darstellung gut kontrollierten effiziente Induktion von menschlichen pluripotenten Stammzellen ausschließlich zu einem bestimmten klinisch relevanten Linie durch eine einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen.
Abbildung 2
Discussion
Eine der großen Herausforderungen für Entwicklungs-Studie und klinische Umsetzung wurde, wie die breite Differenzierungspotential von pluripotenten menschlichen Stammzellen zu einem gewünschten Phänotyp effizient und vorhersagbar Kanal. Obwohl diese Zellen spontan differenzieren können in vitro in Zellen aller Keimblätter, indem Sie durch ein Multi-Linie aggregierte Bühne, verfolgen nur ein kleiner Teil der Zellen einer bestimmten Abstammungslinie 1,4. In diesen hESC-derived Aggregate, das gleichzeitige Auftreten einer erheblichen Menge von sehr unterschiedlichen unerwünschten Zelltypen, die in drei embryonalen Keimblätter aufhalten dürfen oft macht die Entstehung des gewünschten Phänotypen nicht nur ineffizient, sondern unkontrollierbare und unzuverlässig als auch. Obwohl Herz-und neuronalen Linien in früheren Berichten abgeleitet worden, aber nach der Ineffizienz bei der Erzeugung von spezialisierten Zellen durch Keimblattes-Induktion von pluripotenten Zellen und das hohe Risiko der Tumorigenität transplantation haben weitere klinische Übersetzung behindert.
Die hESC Linien zunächst abgeleitet wurden und gepflegt in Co-Kultur mit Wachstum verhaftet embryonalen Maus-Fibroblasten (MEFs) 4. Obwohl mehrere Menschen Feeder, Feeder-frei, und chemisch formulierter Kultur für hESCs 11-13, die entwickelt wurden, die Elemente notwendig und hinreichend für die Erhaltung der Selbst-Erneuerung der menschlichen pluripotenten Zellen bleiben ungelöst. Diese exogenen Feeder-Zellen und biologischen Reagenzien helfen, die langfristig stabile Wachstum der undifferenzierte hES während Maske die Fähigkeit von pluripotenten Zellen zu Entwicklungsstörungen Signale zu reagieren. Die Aufrechterhaltung undifferenzierten Zellkulturen in einem definierten Biologika-freien Kultur, das treue Expansion und steuerbare Differenzierung erlaubt ist einer der Schlüssel zu ihrem therapeutischen Nutzen und Potential. RA war nicht ausreichend, um die neuronale Differenzierung von undifferenzierten hES unter zuvor berichtet condit gepflegt induzierenIonen mit exogenen Feeder-Zellen. Obwohl neuronale Linien in einem relativ frühen Stadium in hESC Differenzierung erscheinen, Behandlung hESC differenzierte multi-lineage Aggregate (Embryoidkörpern) mit RA nur geringfügig erhöht die geringe Ausbeute von Neuronen 1, 14, 15. Um einheitlich Umwandlung von menschlichen pluripotenten Stammzellen zu einer bestimmten Linie zu erreichen, verwendeten wir eine definierte Kultur System in der Lage für die Versicherung der Proliferation von undifferenzierten hES, die Bedingungen für gut kontrollierte effiziente Induktion von pluripotenten hES ausschließlich zu identifizieren, um eine bestimmte klinisch relevante Linie durch einfache Bereitstellung von kleinen Molekülen (Abb. 1, Abb. 2).. Zukünftige Studien werden genetische und epigenetische Kontrolle Moleküle in menschlichen ZNS-Entwicklung zeigen, als Alternativen, die den Weg für kleines Molekül-vermittelten direkten Kontrolle und Modulation der hESC pluripotent Schicksal bereiten bei der Ableitung von klinisch relevanten Linien für regenerative Therapien. Ohne RA-Behandlung, 1-5% HESCs wird spontane Differenzierung in Neurone 1, 14, 15 zu unterziehen. Mit RA-Behandlung haben wir in der Lage,> 95% embryonalen neuronalen Vorläuferzellen und Neuronen aus hES unter define Kultur in einem Prozess, menschliche embryonale Entwicklung 14 emulieren könnte aufrechterhalten zu generieren. Kürzlich haben die bekannten neuronalen Schicksal bestimmen Gene verwendet worden, um Maus-Fibroblasten in adulten neuralen Vorläuferzellen und Neuronen mit einem niedrigen Wirkungsgrad von 0,5-8% 17, 18 transdifferenzieren. Allerdings haben umprogrammiert Körperzellen historisch mit abnormen Genexpression und beschleunigte Seneszenz mit eingeschränkter therapeutischen Nutzen 19-21 in Verbindung gebracht. Schließlich das Protokoll gründeten wir hier zu pluripotenten hES aus der inneren Zellmasse (ICM) oder Epiblast des menschlichen Blastozyste 4 abgeleitet begrenzt, darf nicht auf andere pluripotente Zellen, einschließlich Tier-Ursprung WSR WSR aus früheren Morula gewonnen (acht gelten -cell)-Embryonen 22 und Artificially umprogrammiert Zellen 23.
Disclosures
Die Autoren erklären, konkurrierende Interessen. XHP ist der Gründer der Xcelthera. XHP und EYS haben geistigem Eigentum im Zusammenhang mit hESCs.
Acknowledgments
XHP wurde von National Institute of Health (NIH) Zuschüsse aus National Institute on Aging (NIHK01AG024496) und The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NIHR21HD056530) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| all-trans-Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Human BDNF | PeproTech Inc | AF-450-02 | |
| Human VEGF | PeproTech Inc | AF-100-20 | |
| Human NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H5284 | |
| N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
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