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Neuroscience

लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव Neuronal progenitors और न्यूरॉन्स के कुशल व्युत्पत्ति

Published: October 28, 2011 doi: 10.3791/3273
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1,2, 1,2,5, 1,2,6, 1,2
1San Diego Regenerative Medicine Institute, 2Xcelthera, 3Department of Neurosurgery, Harvard Medical School, 4Division of SCI Research, VA Boston Healthcare System, 5Program in Stem Cell & Regenerative Biology, Sanford-Burnham Medical Research Institute, 6La Jolla IVF

Summary

हम pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं छोटे अणु है, जो मानव neuronal progenitors और neuronal सेल प्रकार में विकासशील सीएनएस के लिए तंत्रिका मरम्मत की एक बड़ी आपूर्ति की व्युत्पत्ति के लिए सक्षम बनाता है के साथ परिभाषित शर्तों के तहत बनाए रखा से सीधे neuroblasts के शामिल होने के लिए एक प्रोटोकॉल की स्थापना की है.

Protocol

1. समाधान और मीडिया तैयारी

  1. जिलेटिन कोटिंग समाधान: 0.1% (w / v) DDH 2 हे, autoclaved में जिलेटिन 4 बजे और स्टोर डिग्री सेल्सियस
  2. Matrigel कोटिंग समाधान. स्टॉक समाधान: 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात, 10 मिलीलीटर ठंडा DMEM या DMEM/F12 जोड़ने के लिए, अच्छा मिश्रण है और विभाज्य 1 सी. / मिलीलीटर निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे, ट्यूब -20 में दुकान ° धीमी गति से पिघलना Matrigel (10 मिलीलीटर) कार्य समाधान: धीमी गति से पिघलना 4 में 1 मिलीलीटर Matrigel विभाज्य ° सी 1-2 के लिए घंटे, 14 DMEM या DMEM/F12 ठंडा मिलीलीटर को हस्तांतरण और निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे अच्छी तरह से कोटिंग से पहले तुरंत मिश्रण.
  3. मानव laminin कोटिंग समाधान: पतला 1 मिलीलीटर मानव laminin समाधान (0.5 मिलीग्राम / Tris में मिलीलीटर NaCl buffered -80 में दुकान ° सी, 1-2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर धीमी गति से पिघलना) के साथ ठंडा DMEM या करने के लिए DMEM/F12 12.5 मिलीलीटर काम कर रहे (40 μg / एमएल) समाधान कोटिंग पहले निष्फल टिशू कल्चर हुड के नीचे तुरंत.
  4. वृद्धि कारक शेयर (500 1000x) समाधान: 10 μg में वृद्धि कारक भंगनिष्फल बफर में मिलीग्राम / (0.5% BSA, 1.0 मिमी डीटीटी, 10% ग्लिसरॉल, 1XPBS) और 50-100 / μl ट्यूब aliquots के रूप में -80 में दुकान ° सी.
  5. अखिल पार retinoic एसिड (1000x) काम कर समाधान: DMSO, aliquots में दुकान में -80 में 10 मिमी डिग्री सेल्सियस
  6. HESC मीडिया: DMEM/F12 या KO DMEM (80%), को सीरम प्रतिस्थापन (20%), एल alanyl एल GLN या एल GLN (2 मिमी), सदस्य nonessential अमीनो एसिड (MNAA, 1X), और β-(100 सुक्ष्ममापी) Mercaptoethanol, फ़िल्टर और 4 बजे दुकान ° सी, 20 एनजी / एमएल bFGF के साथ उपयोग करने से पहले पूरक. या जगह "बाहर दस्तक (को) सीरम प्रतिस्थापन" परिभाषित घटकों के साथ: DMEM/F12 या KO DMEM (100%), एल alanyl एल GLN या एल GLN (2 मिमी), MNAA (1X), सदस्य जरूरी अमीनो एसिड (MEAA, 1X), और β Mercaptoethanol (100 सुक्ष्ममापी), फ़िल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस, (20 एनजी / मिली) bFGF, मानव इंसुलिन (20 μg / मिलीलीटर), ascorbic एसिड (50 μg / के साथ पूरक मिलीलीटर), मानव (50 एनजी / एमएल) activin ए, मानव / albumin Albumax (10 मिलीग्राम / एमएल), और मानव transferrin (8 μg / एमएल) उपयोग करने से पहले.
  7. एनएससी मीडिया: DMEM/F12 (100%), N-2 suppleme(1X) NT, हेपरिन (8 μg / एमएल).

2. प्लेट कोटिंग

  1. कोट प्लेटों के साथ जिलेटिन: ऐड मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें जिलेटिन समाधान की और 2.5 डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर 37 में रातोंरात सेते हैं.
  2. Laminin के साथ कोट प्लेटों: ठंड प्लेटें जिलेटिन में लिपटे और जिलेटिन हटायें, 2.5 मिलीलीटर जोड़ने / अच्छी तरह से Matrigel या मानव laminin कोटिंग का काम कर रहे पूर्व ठंडा समाधान 4 डिग्री सेल्सियस रातोंरात पर 6 अच्छी तरह प्लेटें और सेते gelatinized.

3. Passaging और सीडिंग निर्धारित शर्तों के तहत undifferentiated hESCs

  1. अनुमति दें hESC कालोनियों 5-7 दिनों पुराना हो जाना, और विदारक माइक्रोस्कोप (पूर्व गर्म 37 मंच विदारक डिग्री सेल्सियस) निष्फल हुड विदारक नीचे hESC संस्कृति की थाली ले.
  2. HESC कालोनियों को विभाजित किया जा चयन करें. आकृति विज्ञान, इन कालोनियों को परिभाषित बढ़त संयुक्त राष्ट्र के साथ> 75% (छोटे कॉम्पैक्ट कोशिकाओं) undifferentiated hESCs, आमतौर पर थोड़ा अपारदर्शी (कोशिकाओं, सफेद नुकीला - अप नहीं स्पष्ट - विभेदित कोशिकाओं) होना चाहिएविदारक माइक्रोस्कोप derneath. ध्यान से चयनित कालोनियों की रूपरेखा और विभेदित fibroblast कॉलोनी आसपास परत हैं और सभी विभेदित भागों को हटा दें (यदि किसी भी P2 बाँझ विंदुक टिप के किनारे के साथ) या कॉलोनी के खींच लिया गिलास केशिका. (कृपया ध्यान दें, pluripotent hESCs एक क्षणिक चरण में हैं, इष्टतम स्थितियों के तहत भी सहज भेदभाव से गुजरना है, हालांकि पसंद है, यह पता लगाने theses कोशिकाओं के लिए मुश्किल है विदारक माइक्रोस्कोप के अंतर्गत 100% undifferentiated हैं,> 75% undifferentiated आमतौर पर पास बिंदु के रूप में माना जाता है. विभेदित कोशिकाओं को आम तौर पर बीज और विकसित करने के लिए जारी प्रक्रिया में सफाया passaging नहीं) होगा
  3. Aspirating द्वारा पुराने अस्थायी अलग विभेदित कोशिकाओं से युक्त मीडिया निकालें. HESC bFGF () के बिना एक बार मीडिया के साथ धोएं. 3 मिलीलीटर जोड़ें / अच्छी तरह से ताजा hESC 20 एनजी / मिलीलीटर bFGF युक्त मीडिया.
  4. Undifferentiated hESC कालोनियों छोटे - छोटे टुकड़ों में काटें, और बाँझ विंदुक टिप या खींच केशिका गिलास के साथ अलग.
  5. पूल अलग कॉलोनी टुकड़ों को एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 20 एनजी / एमएल bFGF और पूल hESC साथ युक्त मीडिया के साथ एक बार थाली धो.
  6. Matrigel या लेपित ताजा प्लेटों से मानव laminin समाधान महाप्राण (व्यंजन). अशेष भाजक 4 / मिलीलीटर अच्छी तरह hESC 6 अच्छी तरह से एक थाली कॉलोनी टुकड़े युक्त मीडिया. धीरे इनक्यूबेटर मिलाते हुए बिना प्लेट और हस्तांतरण कॉलोनी टुकड़े बीज 5% सीओ 2 के माहौल के साथ एक humidified 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में परेशान बिना रातोंरात की अनुमति .

4. Retinoic एसिड के साथ निर्धारित संस्कृति प्रणाली के तहत hESCs के तंत्रिका प्रेरण

  1. बोने के बाद 3 दिन में, प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से पुराने मीडिया के सबसे को हटा दें और पर्याप्त मीडिया छोड़ hESC कालोनियों जलमग्न हो (अनुमति hESCs बाहर शुष्क करने के लिए कभी नहीं) की अनुमति. 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से ताजा hESC 20 एनजी / एमएल bFGF और 10 सुक्ष्ममापी retinoic एसिड युक्त मीडिया के साथ बदलें.
  2. ताजा hESC युक्त 20 एनजी / एमएल bFGF और मीडिया के साथ पुराने मीडिया बदलें10 सुक्ष्ममापी retinoic एसिड हर दूसरे दिन की अनुमति है, और तंत्रिका प्रेरित hESC कालोनियों दिन 7 या 8 विकसित करने के लिए. कॉलोनी के भीतर सभी कोशिकाओं बड़े विभेदित कोशिकाओं है कि गुणा करने के लिए जारी रहेगा आकारिकी परिवर्तन से गुजरना होगा. कालोनियों आकार बढ़ाने के लिए दिन 7 या 8 द्वारा थाली को कवर होगा, और कोशिकाओं कालोनियों के कुछ क्षेत्रों में ढेर शुरू हो जाएगा.

5. सतत सस्पेंशन संस्कृति में Neuronal भेदभाव

  1. HESC संस्कृति निष्फल हुड विदारक नीचे खुर्दबीन (पूर्व गर्म 37 मंच विदारक डिग्री सेल्सियस) विदारक की थाली ले लो. ध्यान कालोनियों रूपरेखा और P2 बाँझ विंदुक टिप की बढ़त के साथ fibroblast कॉलोनी आसपास परत (विभेदित कोशिकाओं कॉलोनी के बाहर माइग्रेट) को हटाने या गिलास केशिका खींच लिया.
  2. Aspirating द्वारा पुराने अस्थायी अलग fibroblast कोशिकाओं से युक्त मीडिया निकालें. HESC bFGF () के बिना एक बार मीडिया के साथ धोएं. 3 मिलीग्राम / अच्छी तरह से ताजा hESC मीडिया (bFGF बिना) जोड़ें.
  3. कट मैं तंत्रिकाछोटे - छोटे टुकड़ों में nduced hESC कालोनियों, और बाँझ विंदुक टिप के साथ अलग या खींच लिया गिलास केशिका.
  4. पूल अलग कॉलोनी टुकड़ों को एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से hESC मीडिया (bFGF के बिना) और साथ पूल के साथ एक बार थाली धो.
  5. अशेष भाजक 4 / अच्छी तरह से सीरम मुक्त मिलीलीटर hESC एक 6 अच्छी तरह ultralow लगाव और 37 में एक थाली सेते कॉलोनी टुकड़े युक्त मीडिया ° C humidified इनक्यूबेटर अस्थायी सेलुलर समूहों (neuroblasts) 4-5 दिनों के लिए फार्म करने के लिए अनुमति देने के लिए.

6. चिपकने वाली संस्कृति में neuronal Phenotype परिपक्वता

  1. पूल अस्थायी neuroblasts एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक साथ युक्त मीडिया. 5 मिनट के लिए 1400 rpm पर अपकेंद्रित्र. पुराने आप कर सकते हैं के रूप में ज्यादा के रूप में मीडिया महाप्राण (व्यंजन) और ताजा एनएससी मीडिया के बराबर राशि (20 एनजी / मिली) VEGF, NT-3 (10 एनजी / एमएल), और BDNF (10 एनजी / मिली) युक्त जोड़ें.
  2. विंदुक और नीचे 4 मिलीग्राम / अच्छी तरह से 6 अच्छी तरह प्लेटें अस्थायी neuroblasts और विभाज्य मिश्रण. neuroblasts भी से किया जा सकता हैlaminin / कोलेजन (Matrigel) या मानव laminin सीरम मुक्त एनएससी (20 एनजी / मिली) VEGF, NT-3 (10 एनजी / एमएल), और BDNF (10 एनजी / मिली) युक्त मीडिया में 3 आयामी मैट्रिक्स polymerized में eded . 37 एक प्लेटें स्थानांतरण ° C humidified इनक्यूबेटर neuroblasts रातोंरात संलग्न करने के लिए अनुमति देने के लिए.
  3. एनएससी मीडिया युक्त VEGF (20 एनजी / मिली), NT-3 (10 एनजी / एमएल), और (10 एनजी / मिली) हर दूसरे दिन BDNF बदलें. Neurite असर neuronal कोशिकाओं और pigmented कोशिकाओं के व्यापक नेटवर्क के लिए लगातार खेती और समय के साथ संख्या में वृद्धि के 2 हफ्तों के के भीतर दिखाई शुरू होगा, और 3 महीने के लिए निरंतर हो सकता है.

7. प्रतिनिधि परिणाम:

Retinoic एसिड (आर ए) को परिभाषित संस्कृति प्रणाली में संक्रमण को बनाए रखा pluripotency से विशेष रूप से एक neuroectodermal phenotype (2A छवि) hESCs प्रेरित करने के लिए पर्याप्त प्रदान की गई है. आरए के लिए undifferentiated hESCs के जोखिम पर, कॉलोनी के भीतर सभी कोशिकाओं आकारिकी परिवर्तन से गुजरना होगाबड़े विभेदित कोशिकाओं है कि pluripotency जुड़े मार्करों व्यक्त संघर्ष Oct-4, के रूप में संकेत दिया है, और HNK1 रूप में विभिन्न neuroectoderm जुड़े मार्करों,, AP2, और TrkC (छवि 2B) को व्यक्त शुरू . ये बड़े विभेदित कोशिकाओं गुणा जारी है और कालोनियों के आकार में वृद्धि, सहज कार्यवाही जल्दी neuronal मार्कर β-III ट्यूबिलिन (छवि 2B) व्यक्त करेंगे. अधिक परिपक्व neuronal मार्कर का नक्शा 2 कालोनियों में जहां कोशिकाओं का ढेर है (छवि 2B) के क्षेत्रों में प्रदर्शित करने के लिए शुरू हो जाएगा. Neuroectodermal कोशिकाओं और neuronal भेदभाव की उपस्थिति के साथ संपाती, neuronal विशिष्ट Nurr1 transcriptional कारक, डोपामिनर्जिक neuronal और tyrosine hydroxylase (HI) 16 जीन की भिन्नता सक्रियण में फंसा है, नाभिक (छवि 2B) के लिए टसकाना जाएगा. के बाद अलग, आरए इलाज hESCs निलंबन पंथ में अस्थायी सेलुलर समूहों (neuroblasts) के रूप में होगातंत्रिका भेदभाव प्रक्रिया को जारी रखने के लिए ure. BFGF के हटाने पर और neuroblasts एक टिशू कल्चर प्लेट या एक सीरम मुक्त परिभाषित, β-III ट्यूबिलिन और नक्शा-2-व्यक्त neurite, मध्यम में / laminin कोलेजन 3 आयामी मैट्रिक्स polymerized में वरीयता प्राप्त करने के लिए संलग्न करने के लिए अनुमति के बाद असर कोशिकाओं और pigmented कोशिकाओं दक्षता के रूप में एक ही समय अवधि पर उपचार के बिना hESCs के सहज बहु वंश भेदभाव की तुलना में भारी वृद्धि के साथ प्रकट शुरू होगा, और 3 महीने से अधिक (छवि 2C) के लिए निरंतर किया जा सकता है है.

चित्रा 1
चित्रा 1 अच्छी तरह से नियंत्रित मानव pluripotent स्टेम सेल के कुशल विशेष रूप से छोटे अणुओं के सरल प्रावधान के द्वारा एक विशेष नैदानिक ​​प्रासंगिक वंश प्रेरण का एक योजनाबद्ध.

चित्रा 2
चित्रा 2 (ए) योजनाबद्ध hESCs के निर्देशित neuronal भिन्नता के प्रोटोकॉल समय रेखा के चित्रण . (बी) undifferentiated hESCs परिभाषित संस्कृति प्रणाली के तहत retinoic एसिड (आर ए) के लिए जोखिम होने पर, बड़े विभेदित अक्तूबर 4 (लाल) कॉलोनी के भीतर नकारात्मक कोशिकाओं में उभरने के लिए शुरू के रूप में नकली इलाज नियंत्रण के रूप में (DMSO) hESCs की तुलना में, . RA प्रेरित विभेदित Oct-4-नकारात्मक कोशिकाओं व्यक्त HNK 1-(लाल), AP2 (लाल), (हरा) TrkC शुरू हुआ, तो और (लाल) β-III ट्यूबिलिन, जल्दी neuroectodermal भेदभाव के साथ संगत. इन कोशिकाओं को परिपक्व अंततः neuronal नक्शा दो क्षेत्रों में जहां कोशिकाओं के ढेर लगे में आम तौर पर मार्कर (हरा), व्यक्त करने के लिए जारी रखा. Neuroectodermal कोशिकाओं और neuronal भेदभाव की उपस्थिति के साथ संपाती, neuronal विशिष्ट transcriptional कारक Nurr1 (हरा), में फंसाडोपामिनर्जिक neuronal भिन्नता और tyrosine hydroxylase (HI) जीन की सक्रियता, नाभिक को translocated. सभी कोशिकाओं को उनके नाभिक के DAPI धुंधला (नीला) द्वारा दिखाए जाते हैं. (सी) आरए उपचार उच्च दक्षता के साथ एक neuronal वंश के प्रति भेदभाव लाती neurite असर (लाल) β-III ट्यूबिलिन और मानचित्र - 2 (हरे, एक 3-dimentional मैट्रिक्स में दिखाया गया है) व्यक्त की कोशिकाओं के व्यापक नेटवर्क के द्वारा मूल्यांकन के रूप में. तीर pigmented CNS में उन लोगों की विशिष्ट कोशिकाओं से संकेत मिलता है. सभी कोशिकाओं को उनके नाभिक के DAPI insets में धुंधला (नीला) द्वारा दिखाए जाते हैं. : स्केल सलाखों 0.1 मिमी.

Discussion

दोनों विकासात्मक अध्ययन और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए प्रमुख चुनौतियों में से किया गया है कि कैसे एक वांछित phenotype pluripotent मानव स्टेम कोशिकाओं के व्यापक भेदभाव संभावित चैनल के लिए कुशलतापूर्वक और जाहिर है. हालांकि ऐसी कोशिकाओं इन विट्रो में अनायास बहु वंश कुल मंच के माध्यम से जा रहा द्वारा सभी रोगाणु परतों की कोशिकाओं में अंतर कर सकते हैं, कक्षों की केवल एक छोटा सा अंश दिया वंश 1,4 का पीछा . उन hESC व्युत्पन्न समुच्चय में, व्यापक रूप से मुक़्तलिफ़ अवांछित कोशिका प्रकार है कि तीन भ्रूण रोगाणु परतें में निवास कर सकते हैं की एक पर्याप्त राशि के युगपत उपस्थिति अक्सर वांछित न केवल अक्षम phenotypes के उद्भव करता, लेकिन बेकाबू और अविश्वसनीय रूप में अच्छी तरह. हालांकि हृदय और तंत्रिका प्रजातियों पिछली रिपोर्टों में प्राप्त किया गया है, तथापि, pluripotent कोशिकाओं के रोगाणु परत प्रेरण और tumorigenicity के उच्च जोखिम के माध्यम से विशेष कोशिकाओं को पैदा करने में अक्षमता निम्नलिखित transplantation आगे नैदानिक ​​अनुवाद रुकावट है.

hESC लाइनों शुरू व्युत्पन्न थे और विकास को गिरफ्तार माउस भ्रूणीय (MEFs) fibroblasts 4 के साथ सह - संस्कृति में बनाए रखा. हालांकि कई मानव फीडर, फीडर से मुक्त, और रासायनिक तैयार संस्कृति प्रणालियों 11-13 hESCs के लिए विकसित किया गया है और मानव pluripotent कोशिकाओं के आत्म नवीकरण को बनाए रखने के लिए पर्याप्त आवश्यक तत्वों अनसुलझी रहते हैं. ये exogenous फीडर कोशिकाओं और जैविक अभिकर्मकों मुखौटा जबकि लंबी अवधि के undifferentiated hESCs के स्थिर विकास pluripotent कोशिकाओं की क्षमता के विकास संकेतों के जवाब बनाए रखने में मदद करते हैं. एक परिभाषित biologics मुक्त संस्कृति प्रणाली है कि वफादार विस्तार और नियंत्रणीय प्रत्यक्ष भेदभाव की अनुमति देता में undifferentiated hESCs बनाए रखने उनके चिकित्सीय उपयोगिता और संभावित कुंजी है. आरए पहले रिपोर्ट condit के तहत बनाए रखा undifferentiated hESCs के neuronal भेदभाव प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं थाexogenous फीडर कोशिकाओं से युक्त आयनों. हालांकि तंत्रिका प्रजातियों hESC भेदभाव में एक अपेक्षाकृत प्रारंभिक चरण पर दिखाई देते हैं, आरए के साथ hESC से विभेदित बहु वंश समुच्चय (embryoid निकायों) का इलाज केवल थोड़ा 1 न्यूरॉन्स, 14, 15 की कम उपज में वृद्धि हुई. आदेश में एक विशेष वंश मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं के समान रूपांतरण प्राप्त करने के लिए, हम एक परिभाषित संस्कृति undifferentiated hESCs के प्रसार insuring एक विशेष नैदानिक ​​प्रासंगिक वंश के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से नियंत्रित pluripotent hESCs के कुशल शामिल होने के लिए शर्तों की पहचान करने में सक्षम प्रणाली कार्यरत छोटे अणुओं के सरल प्रावधान (1 छवि, चित्र 2.) के द्वारा . भविष्य के अध्ययन के विकल्प के रूप में मानव CNS के विकास में आनुवंशिक और epigenetic नियंत्रण अणुओं, प्रकट होगा जो छोटे अणु की मध्यस्थता प्रत्यक्ष और hESC pluripotent भाग्य के नियंत्रण मॉडुलन के लिए मार्ग प्रशस्त जब पुनर्योजी उपचार के लिए नैदानिक ​​प्रासंगिक प्रजातियों पाने सकता है. आरए उपचार, 1-5 के बिना% HESCs 1 न्यूरॉन्स, 14, 15 में सहज भेदभाव से गुजरना होगा. आरए उपचार के साथ, हम 95>% भ्रूण neuronal progenitors और न्यूरॉन्स एक प्रक्रिया है कि मानव भ्रूण विकास 14 का अनुकरण सकता है में एक संस्कृति को परिभाषित के तहत बनाए रखा hESCs से उत्पन्न करने में सक्षम किया गया है. हाल ही में, ज्ञात जीन का निर्धारण तंत्रिका भाग्य वयस्क तंत्रिका progenitors और न्यूरॉन्स में एक कम दक्षता लेकर 0.5-8 17%, 18 के साथ माउस fibroblasts transdifferentiate इस्तेमाल किया गया है . हालांकि, reprogrammed दैहिक कोशिकाओं ऐतिहासिक असामान्य जीन अभिव्यक्ति और बिगड़ा चिकित्सीय उपयोगिता 19-21 के साथ त्वरित senescence के साथ संबद्ध किया गया है है. अंत में, हम यहाँ स्थापित प्रोटोकॉल pluripotent भीतर सेल (ICM) जन या मानव ब्लास्टोसिस्ट चार की आद्यबहिर्जनस्तर से प्राप्त hESCs के लिए सीमित है, पशु उत्पन्न ESCs, पहले से morula व्युत्पन्न ESCs (आठ सहित अन्य pluripotent कोशिकाओं, के लिए लागू नहीं हो सकता सेल) चरण 22 भ्रूण, और artificially reprogrammed 23 कोशिकाओं.

Disclosures

लेखकों को प्रतिस्पर्धा हितों घोषणा. XHP Xcelthera के संस्थापक है. XHP और EYS hESCs के लिए संबंधित बौद्धिक गुण है.

Acknowledgments

XHP से एजिंग पर राष्ट्रीय संस्थान (NIHK01AG024496) और Eunice कैनेडी बाल स्वास्थ्य और मानव विकास की श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट (NIHR21HD056530) स्वास्थ्य (NIH) के अनुदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Matrigel BD Biosciences 356231 Growth factor reduced
Human laminin Sigma-Aldrich L6274
all-trans-Retinoic acid Sigma-Aldrich R2625
DMEM/F12 Invitrogen 10565018
DMEM Invitrogen 31053036
DMEM-KO Invitrogen 10829018
Knock-out serum replacement Invitrogen 10828028
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) Invitrogen 11140050
MEM amino acids solution(MEAA, 100X) Invitrogen 11130050
β-Mercapt–thanol Invitrogen 21985023
Albumax Invitrogen 11020021
Ascorbic acid Sigma-Aldrich A4403
Human transferrin Sigma-Aldrich T8158
Human bFGF PeproTech Inc AF-100-18B
Human insulin Invitrogen 12585014
Human activin A PeproTech Inc 120-14E
Human BDNF PeproTech Inc AF-450-02
Human VEGF PeproTech Inc AF-100-20
Human NT-3 PeproTech Inc 450-03
Heparin Sigma-Aldrich H5284
N-2 supplement (100X) Invitrogen 17502048
6-well ultralow attachment plate Corning 3471
6-well plate Corning 3516

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References

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लघु अणु प्रेरण के साथ pluripotent मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से मानव Neuronal progenitors और न्यूरॉन्स के कुशल व्युत्पत्ति
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Parsons, X. H., Teng, Y. D.,… More

Parsons, X. H., Teng, Y. D., Parsons, J. F., Snyder, E. Y., Smotrich, D. B., Moore, D. A. Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction. J. Vis. Exp. (56), e3273, doi:10.3791/3273 (2011).

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