Summary
Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.
Abstract
C'è un grande bisogno insoddisfatto di una clinicamente adeguata fonte di cellule neuronali umane per la riparazione o rigenerazione del danneggiato sistema nervoso centrale (SNC) struttura e circuiti nel settore sanitario di oggi. Terapie basate sulle cellule sono molto promettenti per ripristinare il tessuto nervoso e la funzione perduta per i disturbi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, terapie cellulari basate sul sistema nervoso centrale, cellule staminali neurali hanno incontrato limitazioni e difficoltà di alimentazione da utilizzare in ambito clinico grazie alla loro capacità di espansione limitata di cultura e di plasticità, dopo non aver esteso 1-3 passaging. Nonostante alcuni risultati positivi, il CNS-derivato cellule staminali neurali (hNSCs) sembrano esercitare i loro effetti terapeutici principalmente dalla loro progenie non neuronali attraverso la produzione trofica e le molecole neuroprotettive per salvare le cellule endogene 1-3. In alternativa, pluripotenti le cellule staminali embrionali umane (hESC) proffer cure per una vasta gamma di disturbi neurologici da supplying la diversità dei tipi di cellule umane neuronali del sistema nervoso centrale di sviluppo per la rigenerazione 1,4-7. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di tumorigenicità 7-10. Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specializzate innesti nei pazienti problematici 11-13. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sustaining il pluripotence epiblast di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 14 (vedere uno schema in figura. 1). L'acido retinoico (RA) non induce la differenziazione neuronale di hESC indifferenziata mantenuta su linee 1, 14. E a differenza di CES del mouse, trattando corpi embrionali hESC differenziato (EBS) solo leggermente aumenta la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Tuttavia, dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso acido retinoico (RA) sufficiente a indurre le specifiche del neuroectoderma diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al neuroblasti che ha generato umano progenitori neuronali ed i neuroni nel SNC di sviluppo con alta efficienza (Fig. 2). Abbiamo definito le condizioni per l'induzione della neuroesplosioni diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di una grande quantità di cellule neuronali tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.
Protocol
1. Soluzione e Media Preparazione
- Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH 2 O, autoclave e conservare a 4 ° C.
- Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
- Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con gelida DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
- Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C.
- Tutte le trans retinoico soluzione di lavoro (1000X): 10 mM in DMSO, conservare in aliquote a -80 ° C.
- Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell'uso. O la sostituzione di "knock out (KO) la sostituzione del siero" con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essenziale amminoacidi (MEAA, 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrata e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l'insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell'uso.
- NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), l'eparina (8 mcg / ml).
2. Lastra di rivestimento
- Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato.
- Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte.
3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite
- Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione.
- Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto> hESC 75% indifferenziato (piccole celle compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo ONU definitoderneath il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. (Si prega di notare, hESC pluripotenti sono in una fase transitoria, subiscono differenziazione spontanea anche in condizioni ottimali, anche se si preferisce, è difficile accertare le cellule tesi sono al 100% indifferenziato sotto microscopio da dissezione,> 75% indifferenziati vengono solitamente considerati come il punto di passaggio. L' cellule differenziate di solito non di semi e continuare a crescere, eliminati nel processo di passaging)
- Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF.
- Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.
- Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme.
- Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / pozzetto contenente pezzi dei media hESC colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO 2.
4. Induzione neurale di hESC in Sistema Cultura Definito con Acido Retinoico
- Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM acido retinoico.
- Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e10 mM acido retinoico a giorni alterni, e permettere neurali indotti colonie hESC crescere fino a giorno 7 o 8. Tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumenteranno di dimensioni per coprire la piastra di giorno 7 o 8, e le cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie.
5. Continuando differenziamento neuronale in Cultura Sospensione
- Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro.
- Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF).
- Tagliare il neurali-icolonie hESC nduced in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o tirato capillare di vetro.
- Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme.
- Aliquota 4 ml / e senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) per formare per 4-5 giorni.
6. Fenotipo maturazione neuronale nella cultura adesivo
- Piscina i supporti contenenti neuroblasti galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di fresca NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml).
- Pipetta su e giù per miscelare neuroblasti galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Il neuroblasti può anche essere séeded in un laminina laminina / collagene (Matrigel) o umana polimerizzati 3-dimensionale matrice nel siero senza mezzi NSC contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) . Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire neuroblasti di allegare tutta la notte.
- Sostituire NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) a giorni alterni. Vaste reti di cellule neuronali dei neuriti portanti e cellule pigmentate cominceranno a comparire entro 2 settimane di coltivazione continua e aumento del numero con il tempo, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi.
7. Rappresentante dei risultati:
L'acido retinoico (RA) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo neuroectodermici (Fig. 2A). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a RA, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti di morfologiagrandi cellule differenziate che cessano esprimere pluripotenza associati marcatori, come indicato dalla Oct-4, e cominciare a esprimere diverse neuroectoderma associati marcatori, come HNK1, AP2, e TRKC (Fig. 2B). Queste cellule differenziate grandi continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumenteranno di dimensione, di procedere spontaneamente per esprimere il marker precoce neuronale β-III-tubulina (fig. 2B). Il marcatore più maturo neuronale Mappa-2 si cominciano ad apparire nelle aree delle colonie dove le cellule si sono accumulati (Fig. 2B). In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1, implicato nella differenziazione dei neuroni dopaminergici e l'attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene 16, sarà traslocare al nucleo (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC RA trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) in una setta sospensioneure per continuare il processo di differenziazione neuronale. Dopo la rimozione di bFGF e dopo permettendo neuroblasti per collegare ad una piastra di coltura tissutale o seminati in un laminina / collagene polimerizzato 3-dimensionale matrice di un siero privo di un terreno specifico, β-III-tubulina e mappa-2-esprimere, neuriti portante cellule e cellule pigmentate inizieranno ad apparire con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi (Fig. 2C).
Figura 1 Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole.
Figura 2
Discussion
Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-stadio lignaggio aggregato, solo una piccola frazione di cellule perseguire un 1,4 lignaggio dato. In questi hESC derivati aggregati, la simultanea comparsa di una notevole quantità di ampiamente divergenti tipi di cellule indesiderate che possono risiedere in tre strati germinali embrionali rende spesso la comparsa di fenotipi desiderati non solo inefficiente, ma incontrollabile e inaffidabile pure. Anche se lignaggi cardiache e neuronali sono stati ottenuti in precedenti relazioni, tuttavia, l'inefficienza nella generazione di cellule specializzate attraverso strato germinale, l'induzione di cellule pluripotenti e l'alto rischio di cancerogenicità a seguito transplantation hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche.
Le linee di hESC inizialmente sono stati ottenuti e mantenuti in co-coltura con una crescita arrestato topo fibroblasti embrionali (MEF) 4. Anche se molti di alimentazione umana, senza alimentatore, e sistemi di coltura chimicamente formulati sono stati sviluppati per hESC 11-13, gli elementi necessari e sufficienti per sostenere l'auto-rinnovamento delle cellule pluripotenti umane restano irrisolti. Queste cellule alimentatore esogeni e reagenti biologici aiutano a mantenere la crescita a lungo termine stabile di hESC indifferenziata, mentre la maschera la capacità delle cellule pluripotenti di rispondere ai segnali di sviluppo. Mantenere hESC indifferenziato in un definito biologici sistema privo di cultura che consente l'espansione fedeli e controllabili differenziazione diretta è una delle chiavi per la loro utilità e le potenzialità terapeutiche. RA non era sufficiente a indurre la differenziazione neuronale di hESC indifferenziato mantenuto sotto condiz precedentemente riportatoioni contenenti cellule alimentatore esogeni. Anche se lignaggi neurale compaiono in una fase relativamente precoce nella differenziazione hESC, trattando hESC differenziato multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali) con artrite reumatoide solo leggermente aumentato la bassa resa dei neuroni 1, 14, 15. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1, fig. 2). Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo umano nel sistema nervoso centrale come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento con RA, 1-5HESC% sarà oggetto di differenziazione spontanea in neuroni 1, 14, 15. Con il trattamento con RA, siamo stati in grado di generare> 95% progenitori embrionali neuronali ed i neuroni dalle hESC mantenuto nell'ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano 14. Recentemente, noto neurali destino determinare i geni sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo adulto in progenitori neurali e dei neuroni con un basso livello di efficienza che vanno 0,5-8% 17, 18. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l'espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4, non possono applicarsi a cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivati da precedenti morula (otto celle) embrioni allo stadio 22, e artificially cellule riprogrammate 23.
Disclosures
Gli autori dichiarano interessi in competizione. XHP è il fondatore di Xcelthera. XHP e EYS hanno proprietà intellettuale relativi alle hESC.
Acknowledgments
XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| all-trans-Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Human BDNF | PeproTech Inc | AF-450-02 | |
| Human VEGF | PeproTech Inc | AF-100-20 | |
| Human NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H5284 | |
| N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
References
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Snyder, E. Y. Important precautions when deriving patient-specific neural elements from pluripotent cells. Cytotherapy. 11, 815-824 (2009).
- Redmond, D. E., Bjugstad, K. B., Teng, Y. D., Ourednik, V., Ourednik, J., Wakeman, D. R., Parsons, X. H., Gonzalez, R., Blanchard, B. C., Kim, S. U. Behavioral improvement in a primate Parkinson's model is associated with multiple homeostatic effects of human neural stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 12175-12180 (2007).
- Martino, G., Pluchino, S. The therapeutic potential of neural stem cells. Nature Rev. 7, 395-406 (2006).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Zhang, S., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
- Koch, P., Opitz, T., Steinbeck, J. A., Ladewig, J., Brüstle, O. A rosette-type, self-renewing human ES cell-derived neural stem cell with potential for in vitro instruction and synaptic integration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3225-3230 (2009).
- Elkabetz, Y., Panagiotakos, G., Al Shamy, G., Socci, N. D., Tabar, V., Studer, L. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes. Dev. 22, 152-165 (2008).
- Aubry, L., Bugi, A., Lefort, N., Rousseau, F., Peschanski, M., Perrier, A. L. Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 16707-16712 (2008).
- Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. A. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nature. Medicine. 12, 1259-1268 (2006).
- Wernig, M., Zhao, J. P., Pruszak, J., Hedlund, E., Fu, D., Soldner, F., Broccoli, V., Constantine-Paton, M., Isacson, O., Jaenisch, R. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5856-5861 (2008).
- Richards, M., Fong, C., Chan, W., Wong, P., Bongso, A. Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 20, 933-936 (2002).
- Xu, C., Inokuma, M. S., Denham, J., Golds, K., Kundu, P., Gold, J. D., Carpenter, M. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature. Biotechnol. 19, 971-974 (2001).
- Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., Thomson, J. A. Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferation of human ES cells. Nature. Methods. 2, 185-190 (2005).
- Parsons, X. H., Teng, Y. D., Moore, D. A., Snyder, E. Y. Patents on technologies of human tissue and organ regeneration from pluripotent human embryonic stem cells. Recent Patents on Regenerative Medicine. 1, 142-163 (2011).
- Schuldiner, M., Eiges, R., Eden, A., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Goldstein, R. S., Benvenisty, N. Induced neuronal differentiation of human embryonic stem cells. Brain. Res. 913, 201-205 (2001).
- Perrier, A. L., Tabar, V., Barberi, T., Rubio, M. E., Bruses, J., Topf, N., Harrison, N. L., Studer, L. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
- Vierbuchen, T., Ostermeier, A., Pang, Z. P., Kokubu, Y., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463, 1035-1041 (2010).
- Kim, J., Efe, J. A., Zhu, S., Talantova, M., Yuan, X., Wang, S., Lipton, S. A., Zhang, K., Ding, S. Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 7838-7843 (2011).
- Kim, K., Doi, A., Wen, B., Ng, K., Zhao, R., Cahan, P., Kim, J., Aryee, M. J., Ji, H., Ehrlich, L. I. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467, 285-290 (2010).
- Gore, A., Li, Z., Fung, H. L., Young, J. E., Agarwal, S., Antosiewicz-Bourget, J., Canto, I., Giorgetti, A., Israel, M. A., Kiskinis, E. Somatic coding mutations in human induced pluripotent stem cells. Nature. 471, 63-67 (2011).
- Feng, Q., Lu, S. J., Klimanskaya, I., Gomes, I., Kim, D., Chung, Y., Honig, G. R., Kim, K. S., Lanza, R. Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotent stem cells exhibit limited expansion and early senescence. Stem. Cells. 28, 704-712 (2010).
- Klimanskaya, I., Chung, Y., Becker, S., Lu, S. -J., Lanza, R. Derivation of human embryonic stem cells from single blastomeres. Nat. Protocols. 2, 1963-1972 (2007).
- Park, I. H., Zhao, R., West, J. A., Yabuuchi, A., Huo, H., Ince, T. A., Lerou, P. H., Lensch, M. W., Daley, G. Q. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
