Summary
私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。
Abstract
今日の医療業界で損傷した中枢神経系（CNS）の構造と回路の修復や再生のための臨床的に適切な人間の神経細胞のソースのための大規模な満たされていない必要があります。細胞ベースの治療は、中枢神経系疾患のための失われた神経組織と機能を復元するために偉大な約束を保持する。しかし、に基づいて、細胞治療CNS由来の神経幹細胞は、広範囲1-3継代後の培養と失敗可塑性におけるそれらの限られた拡張機能のため、臨床現場で使用するための供給制限や困難に遭遇した。いくつかの有益な成果にもかかわらず、CNS由来のヒト神経幹細胞は、（hNSCs）内因性細胞が1-3を救うために栄養と神経保護分子を製造を通じて、主に彼らの非神経子孫で、その治療効果を発揮するように見える。また、多能性ヒト胚性幹細胞（ヒトES）supplyinによる神経疾患の幅広い申し出る治療グラム再生1,4-7のための開発CNSにおけるヒト神経細胞タイプの多様性。しかし、所望の表現型に効率的かつ予測可能な多能性ヒトES細胞の広い分化能をチャネルする方法を発達研究と臨床の翻訳の両方にとって大きな課題となっています。従来のアプローチは、しばしば表現型の異質性と不安定性、それゆえ、腫瘍形成7-10のリスクが高いが続いている非効率的で制御不能系統コミットメントの結果として、自発的な胚層の差別化による多能性幹細胞の多系統傾きに依存しています。加えて、未定義の動物/外国の生物学的なサプリメントおよび/ または一般的に単離のために使用されているフィーダ、拡張、およびヒトES細胞の分化は11月13日 、問題のある患者ではそのような細胞の特殊な移植を直接使用することがあります。これらの障害を克服するために、我々はのために必要かつ十分な定義培養系の要素を解決して臨床的に適切なヒトES細胞の de novo導出するためのプラットフォームとして、ヒトES細胞の胚盤葉上層のpluripotenceをustainingと効果的に小分子14（ 図で回路図を参照してください。1）により臨床的に意義のある系統に向かって一様にそのようなヒトES細胞を演出。レチノイン酸（RA）がフィーダ1、14で維持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導しない。とマウスのES細胞とは異なり、ヒトES細胞に分化した胚様体（EB）を治療することで、わずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させる。しかし、小分子および増殖因子の様々なスクリーニングした後、我々はそのような定義された条件は、さらに、人間の神経前駆細胞と神経細胞を生成した神経芽細胞に進行多能性ヒトES細胞から直接神経外胚葉の仕様を誘導するレチノイン酸（RA）が十分なレンダリングされたことがわかった高効率で開発するCNS（ 図2）。我々は、神経の誘導のための条件を定義細胞ベースの治療のための発達段階のスペクトルにわたって人間の神経細胞の大量供給のよく制御された効率的な導出を可能に介在する複数の系統胚様体のステージのない多能性ヒトES細胞から直接爆発、。
Protocol
1。ソリューションとメディアの準備
- ゼラチンコーティング溶液：4で0.1％（w / v）ののddH 2 O、オートクレーブでゼラチンと店舗℃の
- マトリゲルコーティングソリューション。ストック溶液：° C一晩、10mlの氷冷DMEMまたはDMEM/F12を追加、よく混ぜて、アリコートを1ml /滅菌組織培養フードの下にチューブ、-20℃で保存します。4でゆっくりと解凍マトリゲル（10ml）をワーキングソリューション：遅い雪解け4で1ミリリットルマトリゲルのアリコート° C DMEMまたはDMEM/F12を冷やして14ミリリットルまで1-2時間、転送およびコーティングの直前に滅菌組織培養フードの下によく混ぜる。
- 人間のラミニンコーティング溶液：希釈1ミリリットルのヒトラミニン溶液を氷冷DMEMまたはDMEM/F12へと（トリスでは0.5 mg / mlの-80店舗、NaClをバッファ° C、1〜2時間、4℃でゆっくりと解凍） 12.5ミリリットルワーキング溶液（40μg/ ml）を滅菌組織培養フードの下にすぐにコーティングの前に。
- 成長因子のストック溶液（500 - 1000X）：10μgのに成長因子を溶かす滅菌緩衝液に/ mlの（0.5％BSA、1.0mMのDTT、10％グリセロール、1XPBS）と-80℃で50〜100μL/チューブアリコートなどの店舗℃まで
- オールトランスレチノイン酸ワーキングソリューション（1000X）：DMSO中の10mM、-80℃でアリコートの店舗℃に
- hESCのメディア：DMEM/F12またはKO - DMEM（80％）、KO血清の交換（20％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MEM非必須アミノ酸（MNAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）、フィルタリングして4℃で保存、使用前に20 ng / mlのbFGFを補充したC、。または定義されたコンポーネントで、"（KO）血清代替物をノックアウト"交換：DMEM/F12またはKO - DMEM（100％）、L -アラニル- L - GLNまたはL - GLN（2 mM）を、MNAA（1X）、MEM不可欠アミノ酸（MEAA、1X）、およびβ-メルカプトエタノール（100μM）は、濾過し、4℃のbFGF（20 ng / ml）を、ヒトインスリン（20μg/ ml）を、アスコルビン酸（濃度50μg/を添加したC、使用前にml）を、人間のアクチビンA（50 ng / ml）を、（10 mg / ml）をAlbumax /ヒトアルブミン、およびヒトトランスフェリン（8μg/ mlの）。
- NSCメディア：DMEM/F12（100％）、N - 2 supplemeNT（1X）、ヘパリン（8μg/ mlの）。
2。プレートコーティング
- ゼラチンでコートプレートは6ウェルプレートにゼラチン溶液を2.5ml /ウェルを追加し、37℃の加湿インキュベーターで一晩インキュベートする。
- コートのラミニンとプレート：チルゼラチンコートプレートとゼラチン削除は、2.5 mlを追加/予備冷却にもマトリゲルまたはヒトラミニンコーティングワーキングソリューションは、4℃で一晩6ウェルプレートとインキュベートしてゲル化。
3。定義された条件の下で未分化ヒトES細胞を継代し、シーディング
- ヒトES細胞のコロニー5-7日齢に成長できるように、と解剖顕微鏡（プリウォーム37に段階を解剖° C）滅菌フードを解剖下にヒトES細胞培養プレートを取る。
- ヒトES細胞のコロニーを分割する]を選択します。形態学的に、これらのコロニーは、定義されたエッジ国連に通常わずかに不透明> 75％未分化ヒトES細胞を（小さなコンパクト細胞）、（白積み重ねではない細胞ではなく、明確な分化細胞）が必要です解剖顕微鏡をderneath。慎重に選択したコロニーを概説し、コロニーと、すべての差別化された部品をP2滅菌ピペットチップのエッジを持つコロニーの（もしあれば）またはガラスキャピラリーを引っ張っ周囲の差別化された線維芽細胞の層を取り除く。 （解剖顕微鏡による100％未分化な、> 75％が未分化は通常、通過点として考えられている優先するものの、これを知る論文の細胞に難しい、さらに最適な条件下で自発的な分化を受け、人工多能性ヒトESが一時的な段階にある、注意してください。分化した細胞は通常、シードされず、継代過程で除去、成長を続ける）
- 吸引することで、浮動戸分化細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェル20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアを追加します。
- 小片に未分化ヒトES細胞のコロニーを切断し、滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。
- 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。を1ml /一緒に20 ng / mlのbFGFおよびプールを含むだけでなくhESCのメディアで一回プレートを洗浄してください。
- コーティングされた新鮮なプレートからマトリゲルまたはヒトラミニン液を吸引除去する。 6ウェルプレートにコロニーの部分を含むアリコート4ミリリットル/よくhESCのメディア。静かに振盪せずに培養器にプレートを転送し、5％CO 2の雰囲気で加湿37℃のインキュベーターを乱すことなく一晩コロニーピースシードを許可する。
4。レチノイン酸で定義された培養システムの下でヒトESの神経誘導
- 播種後3日目に、プレートの各ウェルから古いメディアのほとんどを削除し、ヒトES細胞のコロニーは、（ヒトES細胞が乾燥しても決して許さない）浸水することを許可するのに十分なメディアを残す。 20 ng / mlのbFGFおよび10μMのレチノイン酸を含む4ミリリットル/よく新鮮なhESCのメディアと交換してください。
- 20 ng / mlのbFGFを含む新鮮なhESCのメディアと古いメディアを交換し、10μMのレチノイン酸一日おきに、と神経誘発性hESCのコロニーは、7日または8に成長することができます。コロニー内のすべてのセルは、乗算を続ける大規模な分化細胞に形態変化を受けることになる。コロニーは、7日または8でプレートをカバーする大きさで増加し、細胞がコロニーのいくつかの分野で積み上げを開始します。
5。浮遊培養での継続的な神経分化
- 滅菌フードを解剖下に解剖顕微鏡（37〜プリ暖かい解剖段階° C）へのヒトES細胞培養プレートを取る。慎重にコロニーを概説し、P2滅菌ピペットチップのエッジでコロニーを取り巻く線維芽細胞の層（分化した細胞がコロニー外に移行）を削除したり、ガラスが管を引っ張った。
- 吸引することで、浮動戸線維芽細胞を含む古いメディアを削除します。かつてhESCのメディア（bFGFを除く）で洗浄する。 3ミリリットル/ウェルの新鮮なhESCのメディア（bFGFをせずに）を追加します。
- カット神経- I細かくnduced hESCのコロニー、および滅菌ピペットチップを使用してデタッチまたはガラスキャピラリーを引っ張った。
- 50 mlコニカルチューブに一緒に分離されたコロニーの部分を含むメディアプール。一緒に1ミリリットル/ウェルhESCのメディア（bFGFを除く）と、プールで一回プレートを洗浄してください。
- 分注し4ミリリットル/よく4〜5日間を形成する浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）を許可するには、37℃加湿インキュベーター中、6ウェル超低取付板とインキュベートしてコロニーの部分を含む無血清hESCのメディア。
6。接着培養におけるニューロン表現型の成熟
- 50 mlコニカルチューブに一緒にフローティング神経芽細胞を含むメディアプール。 5分、1400 rpmで遠心する。あなたができる限り古い培地を吸引除去し、VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含有する新鮮なNSCメディアの同量を追加します。
- 4ミリリットル/ウェル、6ウェルプレートにフローティング神経芽細胞と一定量を混合するために上下にピペッティングし。神経芽細胞はまた、SEになることができるラミニン/コラーゲン（マトリゲル）またはヒトラミニン重合VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を含む無血清NSCメディアにおける3次元マトリックスでeded 。神経芽細胞は一晩アタッチできるように37℃の加湿インキュベーターにプレートを転送する。
- VEGF（20 ng / ml）を、NT - 3（10 ng / mlの）、およびBDNF（10 ng / ml）を一日おきにを含むNSCのメディアを交換してください。神経突起有利子神経細胞と色素細胞の広範なネットワークは、連続培養し、時間と数の増加の2週間以内に表示されるようになります、そして3ヶ月以上持続することができます。
7。代表的な結果：
レチノイン酸（RA）が独占的に多能性の神経外胚葉性の表現型（ 図2A）に移行するために定義された培養系で維持ヒトES細胞を誘導するのに十分レンダリングされます。 RAへの未分化ヒトES細胞の露光時に、コロニー内のすべてのセルは形態変化を受けることになる多能性関連マーカーを発現停止大きな分化した細胞は、などのOCT - 4で示され、様々な神経外胚葉関連などHNK1ようなマーカー、、AP2、およびTrkCを（ 図2B）を発現始まります。これらの大規模な分化細胞は、乗算していきますし、コロニーが初期神経マーカーβ- III -チューブリン（ 図2B）を発現するために自発的に進んで、サイズが大きくなります。より成熟した神経のマーカーMAP - 2は細胞が（ 図2B）積み上げてきたコロニーの地域で表示されるようになります。神経外胚葉細胞と神経分化の外観と一致する、チロシンヒドロキシラーゼ（TH）遺伝子16のドーパミン作動性ニューロンの分化活性化に関与する神経細胞特異的転写因子Nurr1は、核（ 図2B）に転位するでしょう。取り外した後は、RA処理したヒトES細胞は、懸濁液のカルトに浮遊細胞のクラスターを（神経芽細胞）が形成される神経分化のプロセスを継続するものをいい、ラベルにより表示。 bFGFおよび組織培養プレートに付着または無血清定義された培地中でラミニン/コラーゲン重合3次元マトリックス中に播種する神経芽細胞を許可した後、β- III -チューブリンとMAP - 2発現、神経突起の除去時に有利子細胞と色素細胞は、同じ期間での治療なしでヒトES細胞の自発的な多系統分化に比べて効率の大幅な増加と表示されるようになります、そして3ヶ月以上（ 図2C）のために持続することができる。
図1に排他的に小分子の単純な提供により、特定の臨床的に意義のある系統のヒト多能性幹細胞のよく制御された効率的な誘導の概略図。
図2
Discussion
発達研究と臨床の翻訳の両方の主要な課題の一つは、効率的かつ予測可能所望の表現型に多能性ヒト幹細胞の広範な分化能をチャネルする方法をされています。そのような細胞が多系統の集約の段階を経由して、すべての胚葉の細胞に試験管内で自発的に区別することができますが、細胞のほんの一部は、特定の系統の1,4を追求する。これらのヒトES細胞由来の凝集体では、三胚葉の層に存在する可能性が広く発散望ましくない細胞型のかなりの量の同時出現はしばしば非効率的なだけでなく、目的の表現型の出現になりますが、手に負えないと信頼できないとしても。心臓と神経系は、しかし、前回のレポートでtransplantatio以下の多能性細胞の胚葉誘導および腫瘍形成のリスクが高いを通じて特殊な細胞を生成する際に非効率性を導出しているが、nは、さらなる臨床の翻訳を妨げている。
hESCの行は最初に成長-逮捕されたマウス胚性繊維芽細胞（MEF）4との共培養で導出され、維持された。いくつかのヒトフィーダーは、フィーダーフリー、および化学的に定式化培養系がヒトES 11月13日のために開発されているが、ヒト多能性細胞の自己複製を維持するために必要かつ十分な要素が未解決のままです。これらの外因性フィーダー細胞と生物学的試薬は、発達の信号に応答する多能性幹細胞の能力をマスク一方、未分化ヒトES細胞の長期的な安定成長を維持するのに役立ちます。忠実な展開と制御可能な直接差別化を可能に定義されている生物学的製剤血清培養系で未分化ヒトES細胞を維持することは、それらの治療的有用性と可能性への鍵の一つです。 RAは、以前に報告されたコンディットの下で保持未分化ヒトES細胞の神経分化を誘導するのに十分ではなかった外因性フィーダー細胞を含むイオン。神経系はRAでヒトES細胞に分化した多系統の集約を（胚様体）の治療、hESCの分化の比較的早い段階で表示されますがわずかにニューロン1、14、15の低収量を増加させた。一様に特定の系統のヒト多能性幹細胞の変換を達成するために、我々は特定の臨床的に意義のある系統に独占的に多能性ヒトES細胞の十分に制御された効率的な誘導のための条件を識別するために、未分化ヒトES細胞の増殖を保証することのできる定義された培養系を採用小分子の単純な提供（ 図1、図2）によって。今後の研究は再生治療のために臨床的に意義のある系統を派生させる場合にhESCの多能性の運命の小分子を介した直接制御と変調のための道を開く可能性がある、代替案として、ヒトCNSの開発に遺伝的およびエピジェネティックな制御分子を明らかにする。 RA治療、1-5なし％のヒトESはニューロン1、14、15に自発的な分化を受けることになる。 RAの治療では、我々は、人間の胚発生14をエミュレートする可能性があるプロセスで定義する文化の下で保持ヒトES細胞から> 95％の胚性神経前駆細胞と神経細胞を生成することができた。最近、遺伝子を決定する既知の神経の運命は0.5から8パーセント17、18までの低効率と大人の神経前駆細胞と神経細胞にマウスの線維芽細胞の分化形質転換するために使用されている。しかし、再プログラム体細胞は、歴史的に異常な遺伝子発現および障害の治療ユーティリティ19から21までの加速老化と関連している。最後に、我々はここで確立されたプロトコルは、内部細胞塊（ICM）またはヒトの胚盤胞4の胚盤葉上層に由来する多能性ヒトES細胞に限定され、動物由来ES細胞を含む他の多能性細胞、には適用されない場合があります、以前の桑実胚（8から得られるES細胞-セル）段階の胚22、およびartificially再プログラム細胞23。
Disclosures
著者らは、競合する利害を宣言する。 XHPはXceltheraの創設者です。 XHPとEYSは、ヒトES細胞に関連する知的財産を持っている。
Acknowledgments
XHPは、国立老化研究所（NIHK01AG024496）と母子保健と人間開発のユニスケネディシュライバー国立研究所（NIHR21HD056530）から健康（NIH）助成金の国立研究所によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| all-trans-Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Human BDNF | PeproTech Inc | AF-450-02 | |
| Human VEGF | PeproTech Inc | AF-100-20 | |
| Human NT-3 | PeproTech Inc | 450-03 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H5284 | |
| N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
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