Summary
Transfection de gènes par électroporation est amélioré d'environ deux fois lorsque l'orientation du champ électrique est changé lors de l'application d'impulsions, tandis que la viabilité des cellules n'est pas affectée. L'augmentation de la transfection de gènes est causée par l'augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l'entrée d'ADN dans la cellule.
Abstract
Gene électrotransfert est une méthode physique utilisée pour délivrer des gènes dans les cellules par l'application de courtes et intenses impulsions électriques, qui provoquent la déstabilisation de la membrane cellulaire, ce qui rend perméable aux petites molécules et permet le transfert de grosses molécules comme l'ADN. Il représente une alternative aux vecteurs viraux, en raison de son innocuité, l'efficacité et la facilité d'application. Pour gène électrotransfert différents protocoles d'impulsions électriques sont utilisés pour atteindre un maximum transfection de gènes, l'un d'eux est changeant la direction du champ électrique et d'orientation lors de la livraison d'impulsion. Changement de direction du champ électrique et d'orientation augmenter la surface de membrane compétents pour l'entrée d'ADN dans la cellule. Dans cette vidéo, nous montrent la différence dans l'efficacité électrotransfert de gènes lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Pour cette astuce objectif avec des électrodes intégrées et générateur de prototypes de haute tension, ce qui permet de changer de champ électrique dans des directions différentes pendant l'application d'impulsions électriques, ont été utilisés. Gene électrotransfert efficacité est déterminée 24h après l'application d'impulsions que le nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente verte divisée par le nombre de toutes les cellules. Les résultats montrent que la transfection du gène est augmenté lorsque l'orientation du champ électrique au cours d'impulsions électriques de livraison est modifié.
Protocol
1. La culture cellulaire, un plasmide et la préparation de tampon pour l'expérience
- Dans cette expérience ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) sont utilisés. Les cellules sont cultivées dans un mélange nutritif HAM-F12 (AAP) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum fœtal bovin, 400 ul / l gentamicine (tous de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne), et 1 ml / L crystacilin (Pliva, Zagreb, Croatie). Les cellules sont maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l'atmosphère dans l'incubateur pendant 24 heures.
- Amplifier plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, Californie, Etats-Unis) codant la protéine fluorescente verte (GFP) dans la souche DH5a d'Escherichia coli et l'isoler avec Maxi Kit HiSpeed plasmidique (Qiagen, Hilden, Allemagne). Concentration de l'ADN plasmidique (plasmide dissous dans un tampon TE) devrait être déterminée par spectrophotométrie à 260 nm et confirmée par électrophorèse sur gel.
- Préparer isoosmolar tampon phosphate de sodium (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM de MgCl2, 250 mM de saccharose, pH 7,4).
- Le jour de l'expérimentation de préparer la suspension cellulaire par trypsinisation avec 0,25% de trypsine / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne). Centrifuger les cellules pendant 5 min à 1000 rpm (180 xg) à 4 ° C (Sigma, Allemagne) et remettre le culot cellulaire dans un tampon de phosphate de sodium isoosmolar à une densité cellulaire de 5 × 10 6 cellules / ml.
2. L'équipement matériel
- Les cellules sont exposées à des champs électriques dans la pointe de pipette (figure 1) avec des électrodes intégré connecté à un générateur de prototypes de haute tension. La pointe et la géométrie d'électrodes permet l'application de champ électrique relativement homogène et le générateur permet la livraison d'impulsions électriques dans différentes directions. La pointe et le générateur ont été développés au Laboratoire de Biocybernétique, Faculté de Génie Electrique, Université de Ljubljana 1.
Figure 1. Verticale et horizontale (a) section transversale et la photographie (b) de la pointe de la pipette avec des électrodes intégrées. Dans la couleur grise de section est utilisé pour le boîtier en plastique noir et pour les électrodes. La pointe de la pipette avec des électrodes intégrées se compose de quatre électrodes tige cylindrique. Les électrodes sont faites d'acier inoxydable; leur diamètre est de 1,4 mm, électrodes adjacentes sont de 1 mm d'intervalle, et les électrodes opposées sont de 2 mm d'intervalle. Les électrodes sont collées dans le bout de plastique en parallèle et leur longueur applicable est de 30 mm 2.
3. Gene électrotransfert protocole
- Ajouter plasmide pEGFP-N1 à une suspension cellulaire de la concentration de 10 ug / ml.
- Incuber le mélange pendant 2-3 minutes à température ambiante, avant d'appliquer des impulsions électriques.
- Aspire 100 pl de suspension cellulaire dans l'embout de la pipette avec des électrodes intégrées.
- Pour obtenir le meilleur d'efficacité électrotransfert de gènes et de maintenir la viabilité des cellules, les paramètres optimaux d'impulsions électriques doivent être utilisés. Dans cette expérience, un train de 8 impulsions rectangulaires (chacune avec une durée de 1 ms, d'amplitude 225 V à une fréquence de répétition Hz) est appliqué à chaque échantillon, on utilise un générateur de prototypes de haute tension. Deux protocoles différents de champ électrique (figure 2) sont utilisés: dans le premier protocole toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, alors que dans le second protocole impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Le deuxième protocole ne peut être utilisé avec le générateur d'impulsions approprié, qui permet l'application d'impulsions électriques dans différentes directions.
- Immédiatement après l'application d'impulsions de transférer les cellules de la pointe de pipette en 6 plaques et ajouter sérum de veau fœtal (SVF-Sigma, États-Unis) (25% du volume de l'échantillon).
- Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C pour permettre rescellage membrane cellulaire.
- Ajouter 2 ml de HAM-F12 pour chaque échantillon dans 6 puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l'atmosphère dans l'incubateur.
. Figure 2 protocoles de champ électrique: (a) toutes les impulsions sont délivrées dans la même direction, (b) les impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation.
4. L'acquisition des images et la détermination de l'efficacité du gène électrotransfert
- Efficacité du gène électrotransfert est déterminée comme le pourcentage de cellules exprimant la GFP 24h après l'application d'impulsions.
- Les cellules sont observées en utilisant un microscope à fluorescence (dans notre cas Zeiss 200, Axiovert, ZR Allemagne) avec la lumière d'excitation à 488 nm généré par un système monochromateur (polychrome IV, Visitron, Allemagne) et l'émission est détectée à 507 nm. Les images sont enregistrées en utilisant le système d'imagerie (imagerie MetaMorph système, Visitrle, Allemagne), mais d'autres logiciels d'acquisition similaire peut également être utilisé.
- Acquérir au moins cinq images (contraste de phase et fluorescence verte) à un grossissement de 20x objectif.
- Compter les cellules à l'image de contraste de phase et les cellules qui expriment la GFP à l'image de fluorescence verte. Déterminer le pourcentage d'efficacité électrotransfert de gènes en divisant le nombre de cellules qui expriment la GFP avec le nombre de toutes les cellules de chaque image correspondant (figure 3).
5. Les résultats représentatifs:
Figure 3. Le pourcentage de cellules exprimant la GFP lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation est présentée. Les cellules ont été exposées à un train de huit impulsions avec une amplitude 225 V, durée 1 ms et la fréquence de répétition de 1 Hz. Les résultats ont été obtenus par des moyens de microscopie à fluorescence. Chaque valeur dans le graphique représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± déviation standard. En changeant la direction du champ électrique et l'orientation du pourcentage de cellules exprimant la GFP augmente.
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Discussion
Gene électrotransfert est une technique de la biotechnologie polyvalent qui permet le transfert d'ADN dans les cellules au moyen de l'application de courtes impulsions à haute tension électrique 3 et représente une alternative plus sûre à des vecteurs viraux en raison de sa sécurité, efficacité et facilité d'application. Bien électrotransfert de gènes est aujourd'hui largement utilisé pour transfecter tous les types de cellules et de la première phase I des essais cliniques utilisant cette méthode a été rapporté 4, les mécanismes sous-jacents ne sont pas encore complètement compris. Il est connu que l'application d'impulsions électriques d'une résistance suffisante à la cellule provoque une augmentation du potentiel transmembranaire, qui induit la déstabilisation 5 membrane. Perméabilité de la membrane cellulaire est augmenté et les molécules contraire nonpermeant entrer dans la cellule. De nombreux paramètres ont été décrits 6-9, qui influencent l'efficacité de l'électrotransfert de gènes, en particulier l'application de paramètres d'impulsion différentes ont été étudiées pour permettre un meilleur transfert de gènes 10-12. Modification de la direction du champ électrique et d'orientation lors de la livraison d'impulsion augmente la surface de la membrane cellulaire 13 perméabilisées augmente donc zone de compétence disponibles pour le transfert de molécules d'ADN. Il a été montré que le pourcentage de cellules exprimant le gène transféré augmente lorsque la direction du champ électrique et de l'orientation est modifiée pendant l'application 14. Pour ce générateur d'impulsions électriques objectif, qui permet l'application d'impulsions électriques dans différentes directions doit être utilisé en 1. Nous utilisons générateur d'impulsions et de telles pointe de la pipette avec des électrodes intégrées, afin de démontrer la différence dans l'efficacité du gène électrotransfert, quand toutes les impulsions sont livrés dans la même direction ou lorsque des impulsions sont livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Le pourcentage de cellules exprimant transférée gène de la GFP a été évalué 24h après l'application d'impulsions et de l'augmentation des cellules transfectées avec succès lorsque les impulsions ont été livrés en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation (taux de survie 80,8% ± 12% std) en comparaison lorsque toutes les impulsions ont été livrés dans la même direction (taux de survie de 76% ± 16,2% std) a été obtenu.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par l'Agence slovène pour la recherche (projet J2-9770, IP-0510 du centre d'infrastructure et le programme P2-0249). Cette vidéo présente le matériel supplémentaire pour les "électroporation basée sur les technologies et traitements" atelier scientifique et cours de troisième cycle, organisé par la Faculté de génie électrique à l'Université de Ljubljana, en Slovénie. Auteurs remercient également DUSA Hodžić d'avoir bien voulu fournir d'ADN plasmidique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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