Transfection de gènes par électroporation est amélioré d'environ deux fois lorsque l'orientation du champ électrique est changé lors de l'application d'impulsions, tandis que la viabilité des cellules n'est pas affectée. L'augmentation de la transfection de gènes est causée par l'augmentation de la surface de membrane qui est rendue compétente pour l'entrée d'ADN dans la cellule.
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Article de méthode
Modification de la direction et l'orientation du champ électrique pendant des impulsions électriques d'application améliore le transfert de gène plasmidique In vitro
Dans cet article
Résumé
Résumé
Gene électrotransfert est une méthode physique utilisée pour délivrer des gènes dans les cellules par l'application de courtes et intenses impulsions électriques, qui provoquent la déstabilisation de la membrane cellulaire, ce qui rend perméable aux petites molécules et permet le transfert de grosses molécules comme l'ADN. Il représente une alternative aux vecteurs viraux, en raison de son innocuité, l'efficacité et la facilité d'application. Pour gène électrotransfert différents protocoles d'impulsions électriques sont utilisés pour atteindre un maximum transfection de gènes, l'un d'eux est changeant la direction du champ électrique et d'orientation lors de la livraison d'impulsion. Changement de direction du champ électrique et d'orientation augmenter la surface de membrane compétents pour l'entrée d'ADN dans la cellule. Dans cette vidéo, nous montrent la différence dans l'efficacité électrotransfert de gènes lorsque toutes les impulsions sont livrés dans la même direction et quand impulsions sont délivrées en changeant alternativement la direction du champ électrique et d'orientation. Pour cette astuce objectif avec des électrodes intégrées et générateur de prototypes de haute tension, ce qui permet de changer de champ électrique dans des directions différentes pendant l'application d'impulsions électriques, ont été utilisés. Gene électrotransfert efficacité est déterminée 24h après l'application d'impulsions que le nombre de cellules exprimant la protéine fluorescente verte divisée par le nombre de toutes les cellules. Les résultats montrent que la transfection du gène est augmenté lorsque l'orientation du champ électrique au cours d'impulsions électriques de livraison est modifié.
Protocole
1. La culture cellulaire, un plasmide et la préparation de tampon pour l'expérience
- Dans cette expérience ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) sont utilisés. Les cellules sont cultivées dans un mélange nutritif HAM-F12 (AAP) supplémenté avec 2 mM de L-glutamine, 10% de sérum fœtal bovin, 400 ul / l gentamicine (tous de Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Allemagne), et 1 ml / L crystacilin (Pliva, Zagreb, Croatie). Les cellules sont maintenues à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée 2 à 5% l'atmosphère dans l'incubateur pendant 24 heures.
- Amplifier plasmide pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, Californie, Etats-Uni....
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Discussion
Gene électrotransfert est une technique de la biotechnologie polyvalent qui permet le transfert d'ADN dans les cellules au moyen de l'application de courtes impulsions à haute tension électrique 3 et représente une alternative plus sûre à des vecteurs viraux en raison de sa sécurité, efficacité et facilité d'application. Bien électrotransfert de gènes est aujourd'hui largement utilisé pour transfecter tous les types de cellules et de la première phase I des essais cliniques utilisant cette mét.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'Agence slovène pour la recherche (projet J2-9770, IP-0510 du centre d'infrastructure et le programme P2-0249). Cette vidéo présente le matériel supplémentaire pour les "électroporation basée sur les technologies et traitements" atelier scientifique et cours de troisième cycle, organisé par la Faculté de génie électrique à l'Université de Ljubljana, en Slovénie. Auteurs remercient également DUSA Hodžić d'avoir bien voulu fournir d'ADN plasmidique.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires |
| HAM-F12 | AAP | E15-016 | milieu de culture |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| sérum de veau fœtal | AAP | A15-151 | |
| gentamicine | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotiques |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotiques |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | l'ADN plasmidique |
| HiSpeed Maxi Kit Plasmid | Qiagen | 12662 | |
| Na 2 HPO 4 | Merck | F640786 933 | |
| NaH 2 PO 4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl 2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| saccharose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsine / EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pointe de la pipette | Custom made | ||
| générateur d'impulsions électriques | Custom made | ||
| 6 plaques ainsi | PPT | 92406 | |
| 15 ml tube à centrifuger | PPT | 91015 | |
| 75 flacon de culture cm 2 | PPT | 90076 |
Références
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for sma....
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Réimpressions et autorisations
