Summary
Transfecção gênica por eletroporação é melhorada aproximadamente duas vezes quando a orientação do campo elétrico é alterado durante a aplicação do pulso, enquanto que a viabilidade das células não é afetado. O aumento da transfecção do gene é causada pelo aumento da área de membrana que é feito competentes para a entrada de DNA na célula.
Abstract
Gene electrotransfer é um método físico utilizado para entregar genes dentro das células através da aplicação de curto e intenso pulsos elétricos, que causam a desestabilização da membrana celular, tornando-a permeável a pequenas moléculas e permite a transferência de grandes moléculas como o DNA. Ela representa uma alternativa aos vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Para o gene electrotransfer diferentes protocolos de pulso elétrico são utilizadas a fim de alcançar transfecção gênica máximo, um deles está mudando a direção do campo elétrico e orientação durante a entrega de pulso. Mudando de direção e orientação do campo elétrico aumentar a área de membrana competentes para a entrada de DNA na célula. Neste vídeo, demonstramos a diferença na eficácia electrotransfer gene, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção e quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. Para esta dica propósito com eletrodos integrados e de alta tensão do gerador protótipo, que permite a mudança do campo elétrico em diferentes direções durante a aplicação do pulso elétrico, foram usados. Gene electrotransfer eficácia é determinada 24h após a aplicação do pulso como o número de células expressando a proteína fluorescente verde dividido com o número de todas as células. Os resultados mostram que a transfecção de genes é aumentada quando a orientação do campo elétrico durante o parto pulso elétrico é alterado.
Protocol
1. Cultura de células, plasmídeos e preparação de buffer para o experimento
- Neste experimento células de ovário de hamster chinês (CHO-K1) são utilizados. As células são cultivadas em uma mistura de nutrientes HAM-F12 (PAA), suplementado com 2 mM L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 400 mL / l de gentamicina (todos da Chemie GmbH Sigma-Aldrich, Deisenhofen, Alemanha), e 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Croácia). As células são mantidas a 37 ° C em 5% CO 2 umidificado atmosfera na incubadora por 24h.
- Amplificar plasmídeo pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, EUA), codificação de uma proteína fluorescente verde (GFP) em tensão DH5α de Escherichia coli e isolá-lo com o Kit Maxi HiSpeed Plasmid (Qiagen, Hilden, Alemanha). Concentração de DNA plasmidial (plasmídeo dissolvido em tampão TE) deve ser determinada espectrofotometricamente a 260 nm e confirmada por eletroforese em gel.
- Prepare tampão fosfato de sódio isoosmolar (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM de sacarose, pH 7,4).
- No dia do experimento preparar suspensão celular por tripsinização com 0,25% de tripsina / EDTA (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Alemanha). Células centrifugar por 5 min a 1000 rpm (180 xg) a 4 ° C (Sigma, Alemanha) e ressuspender pellet celular em tampão fosfato de sódio isoosmolar a uma densidade de células de 5 × 10 6 células / ml.
2. Equipamentos de hardware
- Células são expostas ao campo elétrico na ponta da pipeta (Figura 1) com eletrodos integrados ligado a um gerador de protótipos de alta tensão. A ponta do eletrodo ea geometria permite a aplicação de relativamente homogênea campo elétrico e do gerador permite a entrega de pulsos elétricos em direções diferentes. A ponta eo gerador foram desenvolvidos no Laboratório de Biocybernetics, Faculdade de Engenharia Elétrica, Universidade de Ljubljana 1.
Figura 1. Vertical e horizontal (a) seção transversal e fotografia (b) da ponta da pipeta com eletrodos integrados. Na cruz de cor cinza seção é usada para a caixa de plástico e preto para os eletrodos. A ponta da pipeta com eletrodos integrados é composta por quatro eletrodos haste cilíndrica. Os eletrodos são feitos de aço inoxidável; seu diâmetro é de 1,4 mm, eletrodos adjacentes são de 1 mm, com eletrodos opostos são 2 mm. Os eletrodos são colados na ponta de plástico em paralelo e seu comprimento aplicável é de 30 mm 2.
3. Gene electrotransfer protocolo
- Adicionar plasmídeo pEGFP-N1 a uma suspensão de células em concentração de 10 mg / ml.
- Incubar a mistura por 2-3 minutos em temperatura ambiente, antes da aplicação de impulsos elétricos.
- Aspire mL 100 de suspensão de células para a ponta da pipeta com eletrodos integrados.
- Para alcançar eficácia melhor electrotransfer gene e manter a viabilidade celular, os parâmetros ideais de pulsos elétricos devem ser usados. Neste experimento um trem de pulsos retangulares de 8 (cada uma com duração de 1 ms, amplitude 225 V na freqüência de 1 repetição Hz) é aplicado a cada amostra, utilizando alta tensão do gerador protótipo. Dois diferentes protocolos de campo elétrico (Figura 2) são usados: no primeiro protocolo todos os pulsos são entregues na mesma direção, enquanto que no segundo protocolo pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. O segundo protocolo só pode ser usado com gerador de pulsos adequado, que permite a aplicação de impulsos elétricos em direções diferentes.
- Imediatamente após a aplicação do pulso de transferência de células de ponta da pipeta em 6 prato bem e adicionar soro fetal bovino (FCS-Sigma, EUA) (25% do volume da amostra).
- Incubar as células por 5 minutos a 37 ° C para permitir a recolagem membrana celular.
- Adicionar 2 ml de HAM-F12 para cada amostra em 6 bem e incubar as células por 24h a 37 ° C em um 5% CO 2 umidificado atmosfera na incubadora.
. Figura 2 protocolos de campo elétrico: (a) todos os pulsos são entregues na mesma direção, (b) pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação.
4. Aquisição de imagem e determinação do gene eficácia electrotransfer
- Eficácia do gene electrotransfer é determinada como a porcentagem de células expressando GFP 24h após a aplicação do pulso.
- As células são observados usando um microscópio de fluorescência (no nosso caso Zeiss 200, Axiovert, ZR Alemanha), com luz de excitação a 488 nm gerada com um sistema monocromador (policromos IV, Visitron, Alemanha) e de emissões é detectada em 507 nm. As imagens são gravadas utilizando imagens do sistema (Metamorph imagem do sistema, Visitrna, Alemanha), mas o software de aquisição semelhante também pode ser usado.
- Adquirir pelo menos cinco imagens (contraste de fase e fluorescência verde) com ampliação de 20x objetivo.
- Contagem de células à imagem de contraste de fase e células que estão expressando GFP à imagem de fluorescência verde. Determinar a percentagem de eficácia electrotransfer gene pela divisão do número de células que estão expressando GFP com o número de todas as células em cada imagem correspondente (Figura 3).
5. Resultados representativos:
Figura 3. A porcentagem de células expressando GFP, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção e quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação é apresentada. As células foram expostas a um trem de oito pulsos com amplitude 225 V, 1 ms de duração e freqüência de repetição de 1 Hz. Resultados foram obtidos por meio de microscopia de fluorescência. Cada valor no gráfico representam a média de três experimentos independentes ± desvio padrão. Mudando a direção do campo elétrico e orientação a porcentagem de células expressando GFP aumenta.
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Discussion
Gene electrotransfer é uma técnica de biotecnologia versátil que permite a transferência de DNA em células por meio de aplicação de curto, pulsos de alta tensão elétrica 3 e representa uma alternativa mais segura para vetores virais, devido à sua eficácia, segurança e facilidade de aplicação. Embora electrotransfer gene hoje é amplamente utilizado para transfecção todos os tipos de células e primeira fase I de ensaios clínicos utilizando este método tem sido relatada 4, os mecanismos subjacentes ainda não estão completamente esclarecidos. Sabe-se, que a aplicação de pulsos elétricos de resistência suficiente para a célula provoca um aumento no potencial transmembrana, o que induz a desestabilização da membrana 5. Permeabilidade da membrana celular é aumentada e as moléculas de outra forma nonpermeant entrar na célula. Muitos parâmetros têm sido descritos 6-9, que influenciam a eficácia do gene electrotransfer, especialmente a aplicação dos parâmetros de pulso diferentes foram estudados para permitir uma melhor transferência de gene 10-12. Mudando a direção do campo elétrico e orientação durante a entrega de pulso aumenta a área dos 13 permeabilizadas da membrana da célula, portanto, aumenta a área competente disponível para transferência de moléculas de DNA. Foi demonstrado, que a porcentagem de células expressando gene transferido aumenta quando a direção do campo elétrico e orientação é alterada durante a aplicação 14. Para este efeito, gerador de pulsos elétricos, que permite a aplicação de impulsos elétricos em direções diferentes tem que ser usado um. Estamos usando como gerador de pulsos e ponteira com eletrodos integrados, a fim de demonstrar a diferença na eficácia electrotransfer gene, quando todos os pulsos são entregues na mesma direção, ou quando os pulsos são entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e de orientação. A porcentagem de células expressando transferidos gene GFP foi avaliada 24h após a aplicação do pulso e aumento de células transfectadas com sucesso quando os pulsos foram entregues mudando alternadamente a direção do campo elétrico e orientação (taxa de sobrevivência de 80,8% ± std 12%) em comparação ao todos os pulsos foram entregues na mesma direção (taxa de sobrevivência de 76% ± std 16,2%) foi obtida.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Agência de Pesquisa esloveno (projeto J2-9770, IP-0510 centro de infra-estrutura e programa P2-0249). Este vídeo representa material suplementar para o "Eletroporação baseado em Tecnologias e Tratamentos" workshop científico e pós-graduação, organizado pela Faculdade de Engenharia Elétrica da Universidade de Ljubljana, na Eslovénia. Autores agradecem também DUSA Hodzic por ter gentilmente cedido DNA plasmidial.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
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