Summary
Darbe uygulama sırasında elektrik alanın yönü değiştiğinde elektroporasyon Gen transfeksiyon yaklaşık iki kat artar, hücre canlılığı etkilenen değildir. Gen transfeksiyon artış hücre içine DNA giriş için yetkili yapılır membran alanı artışı neden olur.
Abstract
Gene electrotransfer küçük moleküllere geçirgen hücre zarı istikrarsızlaştırma neden kısa ve yoğun elektrik bakliyat, uygulama hücrelerin içine genleri teslim etmek için kullanılan fiziksel bir yöntemdir ve DNA gibi büyük moleküllerin transferi sağlar. Bu viral vektörlerin, güvenlik, etkinlik ve uygulama kolaylığı nedeniyle alternatif bir temsil eder. Gen electrotransfer için farklı elektrik nabız protokolleri bunlardan biri darbe doğum sırasında, elektrik alanın yönü ve yönlendirmesi değişiyor, maksimum gen transfeksiyon elde etmek için kullanılır. Elektrik alanın yönü ve yönünün değiştirilmesi hücre içine DNA giriş için yetkili membran alanını artırmak. Bu video, tüm bakliyat aynı yönde teslim edilir ve bakliyat alternatif elektrik alanın yönü ve yönünü değiştirerek teslim edildiğinde gen electrotransfer etkinliği farklılık göstermektedir. Entegre elektrotlar ve elektrik nabız uygulama sırasında farklı yönlere elektrik alan değişimi sağlayan yüksek gerilim prototip jeneratör, bu amaçla ucu için kullanılmıştır. Gene electrotransfer etkinliği, tüm hücrelerin sayısı ile bölünmüş yeşil flüoresan protein eksprese eden hücrelerin sayısı olarak darbe uygulaması 24 saat sonra tespit edilir. Elektrik nabız teslimat sırasında elektrik alan yönü değiştiğinde gen transfeksiyon arttığını göstermektedir.
Protocol
1. Hücre kültürü, plazmid ve deney için hazırlanması tampon
- Bu deneyde Çin hamsteri over hücresi (CHO-K1) kullanılır. Hücreler 2 mM L-glutamin,% 10 fetal sığır serumu, 400 ul / lt gentamisin (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Almanya), ve 1 ile desteklenmiş bir besin karışımı HAM-F12 (PAA) yetiştirilen ml / l crystacilin (Pliva'nın, Zagreb, Hırvatistan). Hücreler 37 ° C, 24 saat için inkübatör nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosfer 'de tutulur.
- Amplify plazmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, CA, USA), yeşil floresan protein (GFP), Escherichia coli DH5α suşu kodlama ve HiSpeed Plazmid Maxi Kiti (Qiagen, Hilden, Almanya) ile izole. Plazmid DNA konsantrasyonu (plazmid TE tampon çözünmüş) 260 nm'de spektrofotometrik olarak belirlenir ve jel elektroforezi tarafından teyit edilmelidir.
- Isoosmolar sodyum fosfat tamponu (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mM sakkaroz, pH 7.4) hazırlayın.
- Deney günü% 0.25 tripsin / EDTA solüsyonu (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Almanya) ile trypsinization hücre süspansiyonu hazırlamak. 4 1000 rpm (180 xg) 5 dakika Santrifüj hücreleri ° C (Sigma, Almanya) ve bir hücre yoğunluğu 5 x 10 6 hücre / ml isoosmolar sodyum fosfat tamponu tekrar süspansiyon hücre pelletini.
2. Donanıma
- Hücreler, bir yüksek gerilim prototip jeneratörüne bağlı entegre elektrotları ile pipet elektrik alanı (Şekil 1) maruz kalmaktadır. Ucu ve elektrot geometrisi, görece homojen bir elektrik alanı uygulama sağlar ve jeneratör, elektrik darbeleri farklı yönlere teslim sağlar. Ucu ve jeneratör Biocybernetics Laboratuvarı, Elektrik Mühendisliği Fakültesi, Ljubljana 1 Üniversitesi geliştirilmiştir.
Şekil 1: Dikey ve yatay (a), kesit ve fotoğraf (b) entegre elektrotlar ile pipet . Kesiti gri renkli plastik gövde ve siyah elektrotlar için kullanılır. Entegre elektrotlar ile pipet dört silindirik çubuk elektrotlar oluşur. Elektrotlar paslanmaz çelikten imal edilmiş, kendi çapı bitişik elektrotlar arasındaki mesafe 1 mm ve karşıt elektrot dışında 2 mm, 1.4 mm. Elektrotlar paralel olarak plastik ucu içine yapıştırılmış ve bunların uygulanabilir uzunluğu 30 mm 2.
3. Gene electrotransfer protokolü
- Konsantrasyonu 10 mg / ml hücre süspansiyonu plazmid pEGFP-N1 ekleyin.
- Elektrik darbeleri uygulamadan önce karışımı oda sıcaklığında 2-3 dakika inkübe edin.
- Aspire 100 ul pipet içine entegre elektrotlar ile hücre süspansiyonu.
- En iyi gen electrotransfer etkinliğini sağlamak ve hücre canlılığını korumak için, elektrik darbeleri optimal parametreleri kullanılmalıdır. Bu deneyde bir tren 8 dikdörtgen bakliyat (her 1 ms 1 Hz tekrarlama frekansı, genliği 225 V süresi ile), yüksek voltaj prototip jeneratörü kullanarak, her bir örnek uygulanır. İki farklı elektrik alan protokolleri (Şekil 2) kullanılır: alternatif elektrik alanın yönü ve yönünü değiştirerek ikinci protokol bakliyat teslim edilir ise ilk protokol tüm bakliyat, aynı yönde teslim edilir. Ikinci protokolü sadece uygun darbe jeneratörü, elektrik darbeleri farklı yönlere uygulama olanağı sağlar kullanılabilir.
- 6 plaka darbe uygulama pipet ucu hücreleri transferi ve hemen sonra eklemek fetal buzağı serumu (FCS-Sigma, USA) (örnek hacmi% 25).
- 5 dakika boyunca 37 ° hücreleri ° C'de hücre zarı mühürlenirken izin.
- Her bir örnek de 6 HAM-F12 2 ml ekleyin ve hücreler 24 saat için 37 ° ° C inkübatör nemlendirilmiş bir% 5 CO 2 atmosferde inkübe edin .
Şekil 2. Elektrik alan protokoller: (a) Tüm bakliyat aynı yönde teslim edilir, (b) bakliyat, alternatif elektrik alanın yönü ve yönünü değiştirerek teslim edilir .
4. Görüntü toplama ve gen electrotransfer etkinliğinin belirlenmesi
- Gen electrotransfer etkinliği GFP darbe uygulamasından sonra 24 saat ifade hücrelerin yüzdesi olarak belirlenir.
- Hücreleri uyarma ışık ile 488 nm dalga boyunda bir monokromatör sistemi (polikrom IV Visitron, Almanya) ve 507 nm dalga boyunda emisyon algılanır ile oluşturulan (bizim durumumuzda Zeiss 200, Axiovert, ZR Almanya) bir floresan mikroskop kullanılarak görülmektedir. Görüntü görüntüleme sistemi (MetaMorph görüntüleme sistemi, Visitr kullanılarak kaydedildi.açık, Almanya), ancak diğer benzer satın alma yazılımı da kullanılabilir.
- En az beş görüntüleri (faz kontrast ve yeşil floresan), 20x amacı büyütme edinin.
- Faz kontrast görüntü ve yeşil floresan görüntü GFP ifade hücreleri hücre sayımı. Her ilgili resim tüm hücrelerin sayısı (Şekil 3), GFP ifade hücrelerinin sayısına bölünmesiyle gen electrotransfer etkinliğinin yüzdesi belirleyin.
5. Temsilcisi sonuçları:
Şekil 3 tüm bakliyat, aynı yönde teslim edilir ve bakliyat, alternatif elektrik alanın yönünü değiştirerek ve yönlendirme sunulmaktadır teslim edildiğinde GFP ifade hücrelerin yüzdesi. Hücreler genlik 225 V, süresi 1 ms ve tekrarlama sıklığı 1 Hz sekiz bakliyat bir tren maruz kaldılar. Sonuçlar floresan mikroskopi sayesinde elde edilmiştir. Grafikte her değer, üç bağımsız deneyler ± standart sapma, ortalama temsil eder. Elektrik alanın yönü ve yönlendirmesi GFP artar ifade hücrelerinin yüzdesini değiştirerek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene electrotransfer kısa, yüksek gerilim elektrik darbeleri 3 uygulanması yoluyla hücre içine DNA transferi sağlar ve güvenilirliği, etkinliği ve uygulama kolaylığı nedeniyle viral vektörlerin daha güvenli bir alternatif temsil eden çok yönlü bir biyoteknoloji tekniktir . Bugün gen electrotransfer 4 bildirilmiştir hücreleri ve ilk aşaması bu yöntemi kullanarak her türlü klinik çalışma transfect yaygın kullanılmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar hala tam olarak anlaşılamamıştır değildir. Hücre için yeterli gücü elektrik atımlarının uygulaması, membran istikrarsızlaştırma 5 indükler transmembran potansiyeli, bir artışa neden olduğu bilinmektedir . Hücre membran geçirgenliği artar ve aksi nonpermeant moleküller hücre içine girer. Birçok parametreler iyi gen transferi 10-12 etkinleştirmek için incelenmiştir gen electrotransfer, özellikle farklı nabız parametreleri uygulama etkinliğini etkileyen, 6-9 tarif edilmiştir. Nabız teslimat sırasında elektrik alanın yönü ve yönünün değiştirilmesi, bu nedenle DNA moleküllerinin transferi için yetkili alanı artar permeabilize hücre zarı 13 alanı artar. Bu, elektrik alanın yönü ve yönlendirmesi uygulama sırasında 14 değiştiğinde, transfer edilen genin ifade hücrelerin yüzdesi arttığı gösterilmiştir. Farklı yönlere elektrik darbeleri uygulama 1 kullanılır sağlayan bu amaçla elektrik darbe jeneratörü. Biz tüm bakliyat aynı yönde teslim edilir veya bakliyat, alternatif elektrik alanın yönü ve yönünü değiştirerek teslim edildiğinde gen electrotransfer etkinlik farkı göstermek için entegre elektrot ile bu nabız jeneratörü ve pipet kullanarak. Transfer GFP geninin ifade hücrelerinin yüzde darbe uygulama 24 saat sonra değerlendirilir ve bakliyat karşılaştırma alternatif elektrik alanın yönü ve yönlendirmesi (sağkalım oranı% 80,8 ± std% 12) değiştirerek teslim edildi başarıyla transfekte hücrelerin artış oldu bütün bakliyat (hayatta kalma oranı% 76 ± std 16,2%), aynı yönde teslim edildi elde edildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Slovenya Araştırma Ajansı (proje J2-9770, altyapı merkezi IP-0510 ve program P2-0249) tarafından desteklenmiştir. Bu video "Elektroporasyon tabanlı Teknolojileri ve Tedaviler", Slovenya Ljubljana Üniversitesi Elektrik Mühendisliği Fakültesi tarafından düzenlenen bilimsel atölye ve lisansüstü ders, ek malzeme temsil eder. Yazarlar nazik plazmid DNA sağlamak için de DUSA Hodzic teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
