Summary
Transfection ג'ין ידי electroporation הוא השתפר בכ פעמיים כאשר הכיוון של השדה החשמלי משתנה במהלך יישום הדופק, תוך כדאיות התא אינו מושפע. הגידול transfection גן נגרמת על ידי גידול של אזור קרום המורכב המוסמכת לכניסת ה-DNA לתוך התא.
Abstract
ג'ין electrotransfer היא שיטה גופנית השתמשו כדי להעביר גנים לתוך התאים על ידי יישום של פולסים חשמליים קצר ואינטנסיבי, אשר גורמות היציבות של קרום התא, מה שהופך אותו חדיר למולקולות קטנות מאפשר העברה של מולקולות גדולות כמו דנ"א. הוא מייצג אלטרנטיבה וקטורים ויראליים, בשל יעילותו, בטיחות וקלות היישום. עבור הגן electrotransfer פרוטוקולים שונים הדופק חשמלי משמשים על מנת להשיג transfection גן מקסימלית, ואחד מהם הוא לשנות את כיוון השדה החשמלי אוריינטציה במהלך הלידה את הדופק. שינוי כיוון השדה החשמלי אוריינטציה להגדיל את שטח קרום המוסמכת לכניסת ה-DNA לתוך התא. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את ההבדל יעילות electrotransfer הגן כאשר כל הפולסים נשלחים באותו כיוון כאשר פולסים מועברים על ידי שינוי לחילופין לכיוון שדה חשמלי בכיוון. לקבלת הטיפ מטרה זו עם אלקטרודות משולב מתח גבוה גנרטור אב טיפוס, המאפשרת שינוי של שדה חשמלי בכיוונים שונים במהלך יישום פולס חשמלי, היו בשימוש. יעילות ג'ין electrotransfer נקבע 24 שעות לאחר היישום דופק כמו במספר התאים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק מחולק למספר של כל התאים. התוצאות מראות כי transfection הגן הוא גדל כאשר כיוון השדה החשמלי בזמן הלידה הדופק חשמלי משתנה.
Protocol
1. תרבית תאים, פלסמיד והכנת חיץ לצורך הניסוי
- בניסוי זה סינית השחלה אוגר תאים (CHO-K1) משמשים. התאים גדלים בתערובת מזין HAM-F12 (PAA) בתוספת 2 מ"מ L-גלוטמין, 10% בסרום שור עוברית, 400 μl / l גנטמיצין (כולם סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, Deisenhofen, גרמניה), ו - 1 מ"ל / אני crystacilin (Pliva, זאגרב, קרואטיה). תאים הם שמרו על 37 מעלות צלזיוס אווירה humidified 5% CO 2 בחממה במשך 24 שעות.
- Amplify פלסמיד pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc, Mountain View, קליפורניה, ארה"ב) קידוד חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) בזן DH5α של Escherichia coli ולבודד אותו עם ערכת HiSpeed מקסי פלסמיד (Qiagen, Hilden, גרמניה). ריכוז ה-DNA פלסמיד (פלסמיד מומס TE החיץ) צריך להיקבע spectrophotometrically ב 260 ננומטר ואושרו על ידי ג'ל אלקטרופורזה.
- הכן נתרן זרחתי isoosmolar חיץ (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mM לאא 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, סוכרוז 250 מ"מ, pH 7.4).
- ביום הניסוי להכין ההשעיה על ידי תא trypsinization עם 0.25% טריפסין / EDTA פתרון (סיגמא אולדריץ Chemie GmbH, Deisenhofen, גרמניה). תאים צנטריפוגה דקות 5 ב 1000 סל"ד (180 XG) בשעה 4 ° C (Sigma, גרמניה) resuspend תא גלולה במאגר פוספט isoosmolar נתרן לצפיפות תאים של 5 × 10 6 תאים / מ"ל.
2. ציוד חומרה
- תאים נחשפים שדה חשמלי פיפטה קצה (איור 1) עם אלקטרודות משולב מחובר מחולל מתח גבוה אב טיפוס. הטיפ וגיאומטריה אלקטרודה מאפשר יישום של שדה חשמלי הומוגני יחסית, הגנרטור מאפשר משלוח של פולסים חשמליים לכיוונים שונים. קצה ועל גנרטור שפותחו במעבדה של Biocybernetics, הפקולטה להנדסת חשמל, באוניברסיטת לובליאנה 1.
באיור 1. אנכיים ואופקיים (א) בסעיף תצלום צלב (ב) קצה פיפטה עם אלקטרודות משולב. ב צבע חתך אפור משמש הדיור פלסטיק שחור האלקטרודות. קצה פיפטה עם אלקטרודות משולב מורכב מארבע אלקטרודות מוט גלילי. אלקטרודות עשויות פלדת אל חלד, קוטר שלהם הוא 1.4 מ"מ, אלקטרודות סמוכים 1 מ"מ זה מזה, ההפך אלקטרודות הם 2 מ"מ זה מזה. האלקטרודות מודבקות לתוך קצה הפלסטיק במקביל אורך החלים שלהם הוא 30 מ"מ 2.
3. ג'ין electrotransfer פרוטוקול
- הוסף פלסמיד pEGFP-N1 להשעיית תא בריכוז 10 מיקרוגרם / מ"ל.
- דגירה את התערובת במשך 2-3 דקות בטמפרטורת החדר, לפני החלת פולסים חשמליים.
- Aspire 100 μl של תאים לתוך ההשעיה קצה פיפטה עם אלקטרודות משולב.
- כדי להשיג את הטוב ביותר electrotransfer יעילות הגן ולשמור כדאיות התא, פרמטרים אופטימליים של פולסים חשמליים אמור לשמש. בניסוי זה רכבת של 8 פולסים מלבני (כל אחד עם משך הזמן של 1 ms, משרעת 225 V בתדר Hz 1 החזרה) על מדגם זה, באמצעות מתח גבוה גנרטור אב טיפוס. שני פרוטוקולים שונים השדה החשמלי (איור 2) משמשים: בפרוטוקול הראשון כל הפולסים נשלחים באותו כיוון, ואילו פולסים פרוטוקול השניה נמסר על ידי שינוי לחילופין לכיוון שדה חשמלי בכיוון. הפרוטוקול השני ניתן להשתמש רק עם גנרטור הדופק המתאים, המאפשר יישום של פולסים חשמליים לכיוונים שונים.
- מיד לאחר יישום הדופק העברת תאים פיפטה קצה לתוך צלחת 6 היטב ולהוסיף העובר עגל בסרום (FCS-Sigma, ארה"ב) (25% של נפח דגימה).
- דגירה תאים 5 דקות בשעה 37 ° C כדי לאפשר פותחת קרום התא.
- הוסף 2 מ"ל של HAM-F12 מדגם כל 6 היטב דגירה תאים עבור 24 שעות ב 37 ° C באווירה humidified 5% CO 2 בחממה.
. באיור 2 פרוטוקולים החשמל שדה: (א) כל פולסים מועברים באותו כיוון, (ב) פולסים מועברים על ידי שינוי כיוון השדה לחילופין אוריינטציה חשמליים.
4. תמונה הרכישה וקביעת היעילות electrotransfer גן
- יעילות של הגן electrotransfer נקבע כאחוז של תאים לבטא GFP 24 שעות לאחר היישום הדופק.
- התאים הם נצפו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (במקרה שלנו Zeiss 200, Axiovert, ZR גרמניה) עם אור עירור ב 488 ננומטר שנוצר עם מערכת monochromator (צבעוני IV, Visitron, גרמניה) פליטת מזוהה ב 507 ננומטר. התמונות הן מוקלטות באמצעות מערכת הדמיה (MetaMorph מערכת הדמיה, Visitrב, גרמניה), אך רכישת תוכנה דומה אחרת יכול לשמש גם.
- רוכשת לפחות חמש תמונות (לעומת פאזה פלואורסצנטי ירוק) בהגדלה 20x אובייקטיבי.
- ספירת תאים בתמונה שלב ניגודיות תאים מביעים GFP בתמונה פלואורסצנטי ירוק. לקבוע את אחוז היעילות electrotransfer הגן על ידי חלוקת מספר התאים מביעים GFP עם מספר כל התאים המתאימים לכל תמונה (איור 3).
5. נציג התוצאות:
איור 3. אחוז התאים לבטא GFP כאשר כל פולסים מועברים באותו כיוון כאשר פולסים מועברים על ידי שינוי הכיוון לחילופין השדה החשמלי וכיוון מוצג. תאים שנחשפו הרכבת של שמונה פולסים עם משרעת 225 V, משך 1 ms ותדירות החזרה של הרץ 1. תוצאות שהתקבלו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כל ערך בגרף מייצגים ממוצע של שלושה ניסויים עצמאיים ± סטיית התקן. על ידי שינוי כיוון השדה החשמלי וכיוון את אחוז התאים לבטא מגביר GFP.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ג'ין electrotransfer היא טכניקה ביוטכנולוגיה צדדי המאפשר העברת דנ"א לתוך התאים באמצעות יישום קצר, פולסים חשמליים במתח גבוה 3 ומהווה חלופה בטוחה יותר וקטורים ויראליים בשל יעילותו, בטיחות וקלות היישום. למרות הגן electrotransfer כיום בשימוש נרחב transfect כל סוגי התאים בשלב הראשון אני הניסוי הקליני בשיטה זו דווחה 4, המנגנונים שבבסיס עדיין לא מובנת לחלוטין. זה ידוע, כי היישום של פולסים חשמליים כוח מספיק לתא גורמת לעלייה בפוטנציאל הטרנסממברני, אשר גורם יציבות הממברנה 5. חדירות קרום התא הוא גדל ומולקולות nonpermeant אחרת להיכנס לתא. פרמטרים רבים תוארו 6-9, אשר משפיעים על היעילות של הגן electrotransfer, במיוחד יישום של פרמטרים שונים נחקרו הדופק כדי לאפשר העברת גנים טובים יותר 10-12. שינוי כיוון השדה החשמלי אוריינטציה במהלך הלידה מגביר את הדופק בשטח של 13 permeabilized קרום התא ולכן מגביר אזור המוסמכת זמין להעברת מולקולות דנ"א. זה היה הראו, כי אחוז התאים לבטא את הגן הועבר עולה כאשר כיוון השדה החשמלי הוא הכיוון השתנה במהלך היישום 14. בשביל זה גנרטור חשמלי דופק מטרה, המאפשרת יישום של פולסים חשמליים לכיוונים שונים יש להשתמש 1. אנחנו משתמשים גנרטור הדופק כאלה קצה פיפטה עם אלקטרודות משולב על מנת להמחיש את ההבדל יעילות electrotransfer הגן, כאשר כל הפולסים נשלחים באותו כיוון, או כאשר פולסים מועברים על ידי שינוי לחילופין לכיוון שדה חשמלי בכיוון. האחוז של תאים לבטא הועבר הגן GFP הוערכה 24 שעות לאחר היישום הדופק ואת הגידול של תאים transfected בהצלחה כאשר פולסים נמסרו על ידי שינוי הכיוון לחילופין השדה החשמלי וכיוון (שיעור ההישרדות 80,8% ± סטנדרטי 12%) בהשוואה כאשר פולסים כל נמסרו באותו כיוון (שיעור ההישרדות של 76% ± std 16,2%) התקבל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות למחקר סלובנית (פרויקט J2-9770, IP-0510 מרכז תשתית תוכנית P2-0249). וידאו זה מהווה חומר משלים עבור "electroporation מבוססי טכנולוגיות וטיפולים" סדנה מדעית קורס אקדמי, המאורגן על ידי הפקולטה להנדסת חשמל באוניברסיטת ליובליאנה, סלובניה. המחברים מודים גם Duša Hodžič עבור באדיבות מתן פלסמיד דנ"א.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
