Summary
Electroporation द्वारा जीन अभिकर्मक लगभग दो गुना सुधार हुआ है जब नाड़ी आवेदन के दौरान बिजली क्षेत्र के उन्मुखीकरण बदल रहा है, जबकि सेल व्यवहार्यता को प्रभावित नहीं है. जीन अभिकर्मक में वृद्धि जो सेल में डीएनए प्रविष्टि के लिए सक्षम बनाया है झिल्ली क्षेत्र की वृद्धि की वजह से है.
Abstract
जीन electrotransfer छोटी और तीव्र बिजली दालों, जो कोशिका झिल्ली की अस्थिरता के कारण आवेदन द्वारा कोशिकाओं में जीन देने के लिए एक भौतिक विधि का इस्तेमाल किया है, यह छोटे अणुओं के लिए पारगम्य बनाने और डीएनए जैसे बड़े अणुओं के हस्तांतरण की अनुमति देता है. यह वायरल vectors के लिए एक विकल्प, अपनी सुरक्षा, प्रभावकारिता, और आवेदन की आसानी के कारण का प्रतिनिधित्व करता है. जीन electrotransfer के लिए अलग बिजली पल्स प्रोटोकॉल के क्रम में अधिकतम जीन अभिकर्मक को प्राप्त करने के लिए, उनमें से एक नाड़ी प्रसव के दौरान बिजली क्षेत्र की दिशा और ओरिएंटेशन बदल रहा है उपयोग किया जाता है. बिजली क्षेत्र की दिशा और ओरिएंटेशन बदलने झिल्ली सेल में डीएनए प्रविष्टि के लिए सक्षम क्षेत्र की वृद्धि हुई है. इस वीडियो में, हम जीन electrotransfer प्रभावकारिता में अंतर है जब सभी दालों एक ही दिशा में वितरित कर रहे हैं और जब दालों वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा और ओरिएंटेशन बदलने के द्वारा वितरित कर रहे हैं प्रदर्शित करता है. एकीकृत इलेक्ट्रोड और उच्च वोल्टेज प्रोटोटाइप जनरेटर, जो बिजली पल्स आवेदन के दौरान अलग अलग दिशाओं में बिजली के क्षेत्र की बदलती करने की अनुमति देता है के साथ इस उद्देश्य के टिप के लिए इस्तेमाल किया, थे. जीन electrotransfer प्रभावकारिता हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन सभी कोशिकाओं की संख्या के साथ विभाजित व्यक्त कोशिकाओं की संख्या के रूप में पल्स आवेदन के बाद 24 निर्धारित किया जाता है. परिणाम बताते हैं कि जीन अभिकर्मक बढ़ जाती है जब बिजली पल्स प्रसव के दौरान बिजली क्षेत्र उन्मुखीकरण बदल रहा है.
Protocol
1. सेल संस्कृति, प्लाज्मिड और प्रयोग के लिए बफर तैयारी
- इस प्रयोग में चीनी हम्सटर अंडाशय कोशिकाओं (चो-K1) किया जाता है. कक्ष एक पोषक तत्व मिश्रण HAM-F12 (Paa) 2 मिमी एल glutamine, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 400 μl / एल gentamicin (सभी सिग्मा Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, जर्मनी से), और 1 के साथ पूरक में बड़े हो रहे हैं / एमएल एल crystacilin (Pliva, ज़गरेब, क्रोएशिया). कक्ष 37 ° humidified 24 के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में वातावरण में सी रखा जाता है .
- बढ़ाना प्लाज्मिड pEGFP-N1 (Clontech लेबोरेटरीज इंक, माउंटेन व्यू, सीए, संयुक्त राज्य अमेरिका) Escherichia कोलाई के DH5α तनाव में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के एन्कोडिंग और यह HiSpeed प्लाज्मिड मैक्सी किट (Qiagen, Hilden, जर्मनी) के साथ अलग. प्लास्मिड डीएनए एकाग्रता (ते बफर में प्लाज्मिड भंग) spectrophotometrically 260 एनएम पर निर्धारित किया जाना चाहिए और जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा की पुष्टि की.
- Isoosmolar सोडियम फास्फेट (10 मिमी ना 2 HPO 4, 10 मिमी नाह 2 पीओ 4, 1 मिमी MgCl 2, 250 मिमी sucrose, 7.4 पीएच) बफर तैयार करें .
- 0.25% / trypsin EDTA समाधान (सिग्मा Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, जर्मनी) के साथ प्रयोग के दिन trypsinization द्वारा सेल निलंबन तैयार. 4 में 1000 rpm (180 XG) में 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं ° सी (सिग्मा, जर्मनी) और 5 के एक सेल घनत्व × 10 6 कोशिकाओं / एमएल isoosmolar सोडियम फॉस्फेट बफर में resuspend सेल गोली .
2. हार्डवेयर उपकरण
- कक्ष विंदुक टिप में बिजली के क्षेत्र (चित्रा 1) के लिए एकीकृत एक प्रोटोटाइप उच्च वोल्टेज जनरेटर से जुड़ा इलेक्ट्रोड के साथ उजागर कर रहे हैं. टिप और इलेक्ट्रोड ज्यामिति अपेक्षाकृत सजातीय बिजली क्षेत्र के आवेदन की अनुमति देता है और जनरेटर बिजली के दालों के अलग अलग दिशाओं में वितरण की अनुमति देता है. टिप और जनरेटर Biocybernetics, इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय, Ljubljana के एक विश्वविद्यालय की प्रयोगशाला में विकसित किए गए.
चित्रा 1 ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज () पार अनुभाग और तस्वीर (ख) एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ विंदुक टिप. क्रॉस सेक्शन ग्रे रंग में प्लास्टिक इलेक्ट्रोड के लिए आवास और काले रंग के लिए प्रयोग किया जाता है. एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ विंदुक टिप चार बेलनाकार रॉड इलेक्ट्रोड के होते हैं. इलेक्ट्रोड स्टेनलेस स्टील का बना रहे हैं, उनके व्यास 1.4 मिमी है, आसन्न इलेक्ट्रोड 1 मिमी अलावा रहे हैं, और विपरीत इलेक्ट्रोड अलावा 2 मिमी. इलेक्ट्रोड समानांतर में प्लास्टिक टिप में चिपका रहे हैं और उनके लागू लंबाई 30 मिमी 2 है.
3. जीन electrotransfer प्रोटोकॉल
- 10 एकाग्रता / μg मिलीलीटर में एक सेल निलंबन प्लाज्मिड pEGFP-N1 जोड़ें.
- कमरे के तापमान पर 2-3 मिनट के लिए बिजली दालों को लागू करने से पहले मिश्रण, सेते हैं.
- अस्पायर एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ विंदुक टिप में 100 सेल निलंबन के μl.
- सबसे अच्छा जीन electrotransfer प्रभावकारिता को प्राप्त करने और बनाए रखने के सेल व्यवहार्यता, बिजली के दालों के इष्टतम मापदंडों इस्तेमाल किया जाना चाहिए. इस प्रयोग में 8 आयताकार दालों (1 एमएस, आयाम 225 1 हर्ट्ज पुनरावृत्ति आवृत्ति में वी की अवधि के साथ प्रत्येक) की एक ट्रेन के प्रत्येक नमूना के लिए लागू किया जाता है, उच्च वोल्टेज प्रोटोटाइप जनरेटर का उपयोग कर. दो अलग बिजली के क्षेत्र प्रोटोकॉल (चित्रा 2) का उपयोग किया जाता है: पहली प्रोटोकॉल में सभी दालों एक ही दिशा में वितरित कर रहे हैं, जबकि दूसरा प्रोटोकॉल दालों में वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा और ओरिएंटेशन बदलने के द्वारा वितरित कर रहे हैं. दूसरी प्रोटोकॉल केवल उपयुक्त पल्स जनरेटर है, जो बिजली के दालों के अलग - अलग दिशाओं में आवेदन की अनुमति देता है के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पल्स आवेदन के तुरंत बाद 6 अच्छी तरह से थाली में पिपेट टिप से कोशिकाओं हस्तांतरण और जोड़ने भ्रूण बछड़ा (FCS सिग्मा, संयुक्त राज्य अमेरिका) सीरम (नमूना मात्रा का 25%).
- 37 पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेते डिग्री सेल्सियस कोशिका झिल्ली resealing की अनुमति के लिए.
- प्रत्येक नमूने के लिए 6 अच्छी तरह से में HAM-F12 के 2 मिलीलीटर जोड़ें humidified इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2 माहौल में 24 घंटों के लिए 37 कोशिकाओं ° सी सेते हैं.
. चित्रा 2 इलेक्ट्रिक क्षेत्र प्रोटोकॉल: (क) सभी दालों को एक ही दिशा में वितरित कर रहे हैं, (ख) दालों वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा और ओरिएंटेशन बदलने के द्वारा दिया जाता है.
4. छवि के अधिग्रहण और जीन electrotransfer प्रभावकारिता का दृढ़ संकल्प
- जीन electrotransfer की प्रभावकारिता पल्स आवेदन के बाद GFP 24 व्यक्त कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में निर्धारित किया जाता है.
- कोशिकाओं 488 एनएम पर एक monochromator प्रणाली (विचित्र चतुर्थ, Visitron, जर्मनी) और उत्सर्जन 507 एनएम पर पता चला है के साथ उत्पन्न उत्तेजना प्रकाश के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी (हमारे मामले में 200 Zeiss, Axiovert, ZR जर्मनी) का उपयोग कर मनाया जाता है. छवियों इमेजिंग प्रणाली (MetaMorph इमेजिंग प्रणाली, Visitr का उपयोग कर दर्ज कर रहे हैंपर, जर्मनी), लेकिन अन्य समान अधिग्रहण सॉफ्टवेयर भी इस्तेमाल किया जा सकता है.
- 20x उद्देश्य बढ़ाई पर कम से कम पांच छवियाँ (चरण विपरीत और हरी प्रतिदीप्ति) मोल.
- चरण विपरीत छवि और कोशिकाओं है कि हरी प्रतिदीप्ति छवि में GFP व्यक्त कर रहे हैं में कोशिकाओं की गणना. कोशिकाओं की संख्या कि प्रत्येक इसी छवि में सभी कक्षों की संख्या (चित्रा 3) के साथ GFP व्यक्त कर रहे हैं विभाजित करके जीन electrotransfer प्रभावकारिता का प्रतिशत निर्धारित करते हैं.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 3. GFP व्यक्त है जब सभी दालों एक ही दिशा में वितरित कर रहे हैं और जब दालों वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा बदलने और ओरिएंटेशन में प्रस्तुत किया है के द्वारा वितरित कर रहे हैं कोशिकाओं का प्रतिशत. कक्ष आयाम 225 वी, अवधि 1 एमएस और 1 हर्ट्ज की पुनरावृत्ति आवृत्ति के साथ आठ दालों की एक ट्रेन के लिए खुल गए थे. परिणाम प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से प्राप्त किया गया. ग्राफ में प्रत्येक मान का मतलब तीन स्वतंत्र ± मानक विचलन प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करते हैं. बिजली क्षेत्र की दिशा और GFP बढ़ जाती व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत उन्मुखीकरण को बदलने.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
जीन electrotransfer एक बहुमुखी जैव प्रौद्योगिकी तकनीक है कि कोशिकाओं में डीएनए के हस्तांतरण और छोटी, उच्च वोल्टेज बिजली के 3 दालों लागू करने के साधन के द्वारा सक्षम बनाता है एक सुरक्षित वायरल वैक्टर अपनी सुरक्षा, प्रभावकारिता, और आवेदन की आसानी के कारण के लिए वैकल्पिक का प्रतिनिधित्व करता है. यद्यपि आज जीन electrotransfer व्यापक रूप है 4 सूचना दी गई कोशिकाओं और पहले चरण के सभी प्रकार मैं चिकित्सीय परीक्षण इस पद्धति का उपयोग करके transfect करने के लिए प्रयोग किया जाता है, अंतर्निहित तंत्र अभी भी समझ रहे हैं पूरी तरह से नहीं. यह ज्ञात है कि सेल करने के लिए पर्याप्त शक्ति के बिजली के दालों के आवेदन transmembrane क्षमता है, जो झिल्ली 5 अस्थिरता लाती में वृद्धि का कारण बनता है. सेल झिल्ली पारगम्यता वृद्धि हुई है और अन्यथा nonpermeant अणु कोशिका में प्रवेश. कई मापदंडों 6-9 में वर्णित किया गया है, जो जीन electrotransfer, विशेष रूप से विभिन्न पल्स मापदंडों का आवेदन की प्रभावकारिता के प्रभाव के लिए बेहतर जीन हस्तांतरण 10-12 सक्षम थे अध्ययन. पल्स प्रसव के दौरान बिजली क्षेत्र की दिशा और ओरिएंटेशन बदलना permeabilized कोशिका झिल्ली 13 इसलिए सक्षम डीएनए अणु के हस्तांतरण के लिए उपलब्ध क्षेत्र बढ़ के क्षेत्र में बढ़ जाती है. यह दिखाया था कि हस्तांतरित जीन व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ जाती है जब 14 आवेदन के दौरान बिजली क्षेत्र की दिशा और ओरिएंटेशन बदल रहा है . इस उद्देश्य के बिजली पल्स जनरेटर है, जो बिजली के दालों के अलग - अलग दिशाओं में आवेदन की अनुमति देता है 1 इस्तेमाल किया जा के लिए. हम एकीकृत इलेक्ट्रोड के साथ जैसे पल्स जनरेटर और विंदुक टिप का उपयोग कर रहे हैं क्रम में जीन electrotransfer प्रभावकारिता में अंतर है जब सभी दालों एक ही दिशा में वितरित कर रहे हैं या जब दालों वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा और ओरिएंटेशन बदलने के द्वारा दिया जाता है का प्रदर्शन. पल्स आवेदन के बाद हस्तांतरित GFP जीन व्यक्त कोशिकाओं का प्रतिशत 24 मूल्यांकन किया गया था और जब जब दालों वैकल्पिक रूप से बिजली के क्षेत्र दिशा और ओरिएंटेशन (जीवित रहने की दर 80,8% ± एसटीडी 12%) को बदलने के द्वारा की तुलना में दिया गया सफलतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं की वृद्धि सभी दालों को एक ही दिशा में दिया गया (जीवित रहने की दर 76% ± एसटीडी 16,2%) प्राप्त.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम स्लोवेनियाई अनुसंधान एजेंसी (J2 9770 परियोजना, ढांचागत केंद्र आईपी 0510 और P2-०२४९ कार्यक्रम) द्वारा समर्थित किया गया था. इस वीडियो "electroporation आधारित प्रौद्योगिकी और उपचार" वैज्ञानिक कार्यशाला और स्नातकोत्तर कोर्स, Ljubljana, स्लोवेनिया के विश्वविद्यालय में इलेक्ट्रिकल इंजीनियरिंग के संकाय द्वारा आयोजित के लिए पूरक सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है. लेखकों को भी कृपया प्लास्मिड डीएनए प्रदान करने के लिए Duša Hodžič धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
