Summary
Гена трансфекции электропорацией улучшается примерно в два раза, когда ориентация электрического поля изменяется во время нанесения импульса, а жизнеспособность клеток не влияет. Увеличение трансфекции гена обусловлена увеличением мембраны области, которая производится компетентным для ДНК вступления в клетке.
Abstract
Гена электропереноса является физический метод используется для доставки генов в клетки путем применения коротких и интенсивных электрических импульсов, которые вызывают дестабилизацию клеточных мембран, что делает ее проницаемой для небольших молекул и позволяет передачу больших молекул, таких как ДНК. Он представляет собой альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Для гена электропереноса различных электрических импульсов протоколы используются для того, чтобы достичь максимальной трансфекции генов, один из них меняет направления электрического поля и ориентацию в течение импульса доставки. Изменение направления электрического поля и ориентации увеличение мембранного области компетентным для ДНК вступления в клетке. В этом видео, мы демонстрируем различие в гене эффективность электропереноса, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Для этого наконечник со встроенным электродов и высоковольтной прототип генератора, который позволяет изменять электрического поля в разных направлениях во время применения электрических импульсов, были использованы. Гена электропереноса эффективность определяется 24 часов после применения в качестве импульса число клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок разделить с числом всех клеток. Результаты показывают, что ген трансфекции увеличивается, когда электрические поля при ориентации электрических доставки импульс изменился.
Protocol
1. Клеточные культуры, плазмиды и буферных подготовки к эксперименту
- В этом эксперименте яичника китайского хомячка клеток (СНО-К1) используются. Клетки, выращенные в питательной смеси HAM-F12 (ПАА) с добавлением 2 мМ L-глутамина, 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 400 мкл / л гентамицина (все от Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Германия), и 1 мл / л crystacilin (Плива, Загреб, Хорватия). Клетки хранятся при температуре 37 ° С в увлажненной 5% CO 2 в атмосферу инкубатора в течение 24 часов.
- Amplify плазмиды pEGFP-N1 (Clontech Laboratories, Inc, Mountain View, Калифорния, США), кодирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) в DH5α штамм кишечной палочки и изолировать его с HiSpeed плазмиды Комплект Maxi (Qiagen, Hilden, Германия). Плазмиды концентрации ДНК (плазмиды, растворенных в ТЕ буфере) должна быть определена спектрофотометрически при 260 нм и подтвердил помощью гель-электрофореза.
- Подготовка isoosmolar буфера фосфата натрия (10 мМ Na 2 HPO 4, 10 мМ NaH 2 PO 4, 1 мМ MgCl 2, 250 мМ сахарозы, рН 7,4).
- В день эксперимента подготовить суспензии клеток путем трипсинизации с 0,25% трипсин / ЭДТА раствором (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Германия). Центрифуга клетки в течение 5 мин при 1000 оборотов в минуту (180 мкг) при 4 ° С (Sigma, Германия) и ресуспендируют осадок клеток в isoosmolar буфера фосфата натрия в клетку плотностью 5 × 10 6 клеток / мл.
2. Аппаратное оборудование
- Клетки подвергаются воздействию электрического поля в пипетки (рис. 1) с интегрированным электроды подключены к высоковольтной прототип генератора. Наконечник и геометрии электродов позволяет применение сравнительно однородное электрическое поле и генератор позволяет доставки электрических импульсов в разных направлениях. Наконечник и генератор были разработаны в лаборатории биокибернетики, факультет электротехники, Университет Любляны 1.
Рисунок 1. Вертикальная и горизонтальная () сечения и фотография (б) пипетки с интегрированным электродов. В разделе крест цвета серого используется для пластиковый корпус и черный для электродов. Пипетки с интегрированным электродов состоит из четырех цилиндрических электродов стержня. Электроды изготовлены из нержавеющей стали, их диаметр составляет 1,4 мм, прилегающие электроды 1 мм друг от друга, а напротив электродов 2 мм друг от друга. Электроды вклеены в пластиковый наконечник параллельно и применимых длина составляет 30 мм 2.
3. Гена электропереноса протокола
- Добавить плазмиды pEGFP-N1 к суспензии клеток в концентрации 10 мкг / мл.
- Выдержите смесь в течение 2-3 минут при комнатной температуре, перед применением электрических импульсов.
- Aspire 100 мкл клеточной суспензии в пипетку наконечник со встроенным электродов.
- Для достижения наилучших эффективность гена электропереноса и поддерживать жизнеспособность клеток, оптимальных параметров электрических импульсов должен быть использован. В этом эксперименте поезд 8 прямоугольных импульсов (каждая длительностью 1 мс, амплитудой 225 В при частоте повторения 1 Гц) применяется к каждому образцу, используя высоковольтные прототип генератора. Два различных электрических протоколов поля (рис. 2) используются: в первый протокол все импульсы передаются в одном направлении, тогда как во втором импульсов протокола поставляются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Второй протокол может быть использован только с соответствующими генератора импульсов, что позволяет применение электрических импульсов в разных направлениях.
- Сразу после передачи импульса применение клетки от кончика пипетки на 6 лунками и добавить эмбриональной телячьей сыворотки (FCS-Sigma, США) (25% от объема выборки).
- Инкубируйте клетки в течение 5 мин при 37 ° С, чтобы опечатывания клеточной мембраны.
- Добавить 2 мл HAM-F12 для каждого образца в 6 и инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 ° С в увлажненной 5% СО 2 атмосферы в инкубаторе.
. Рисунок 2 Электрическое поле протоколов: (а) все импульсы поступают в том же направлении, (б) импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию.
4. Приобретение изображения и определение эффективности генной электропереноса
- Эффективность генной электропереноса определяется как процент клеток, экспрессирующих GFP 24 часов после импульса приложения.
- Клетки, наблюдаемые с помощью флуоресцентного микроскопа (в нашем случае Zeiss 200, Axiovert, З. Германия) при возбуждении светом в 488 нм, созданные с системой монохроматора (полихромные IV, Visitron, Германия) и излучения обнаружен на 507 нм. Изображения записываются с использованием изображений системы (Метаморф изображений системы, Visitrна, Германия), но и других подобных программ приобретения также могут быть использованы.
- Приобретайте не менее пяти изображений (фазового контраста и зеленая флуоресценция) в 20-кратным целью увеличения.
- Граф клеток в фазе контраста изображения и клетки, которые выражают GFP в зеленую флуоресценцию изображения. Определить процент генов эффективность электропереноса путем деления числа клеток, которые выражают GFP с числом всех клеток в каждом соответствующее изображение (рис. 3).
5. Представитель результаты:
Рисунок 3. Процент клеток, экспрессирующих GFP, когда все импульсы поступают в том же направлении и когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентация представлена. Клетки подвергались поезд из восьми импульсов с амплитудой 225 В, длительность 1 мс и частотой повторения 1 Гц. Результаты были получены с помощью флуоресцентной микроскопии. Каждое значение в графе представляют собой среднее из трех независимых экспериментах ± стандартное отклонение. Путем изменения направления электрического поля и ориентации процент клеток, экспрессирующих GFP увеличивается.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Гена электропереноса это универсальный метод биотехнологии, который позволяет передачу ДНК в клетки с помощью применения Короче говоря, высоковольтных электрических импульсов 3 и представляет собой более безопасную альтернативу вирусные векторы, из-за его безопасность, эффективность и простота применения. Хотя электропереноса сегодня ген широко используется для трансфекции всех типов клеток и первый этап клинических испытаний с помощью этого метода было сообщено 4, основные механизмы до сих пор не выяснен. Известно, что применение электрических импульсов достаточной прочностью, чтобы клетка вызывает увеличение трансмембранного потенциала, который вызывает дестабилизацию мембраны 5. Проницаемость клеточной мембраны увеличивается и иным nonpermeant молекулы проникают в клетку. Многие параметры были описаны 6-9, которые влияют на эффективность гена электропереноса, в особенности применения различных параметров импульса изучались с целью обеспечения более переноса генов 10-12. Изменение направления электрического поля и ориентацию в течение импульса доставки увеличивает площадь проницаемыми 13 клеточных мембран, следовательно, увеличивает компетентных площадь, доступную для передачи молекул ДНК. Было показано, что процент клеток, экспрессирующих ген передается увеличивается при направлении электрического поля и ориентация изменяется при приложении 14. Для этой цели электрический генератор импульсов, что позволяет применение электрических импульсов в разных направлениях, должен быть использован 1. Мы используем такой генератор импульсов и пипетки с интегрированным электроды, чтобы продемонстрировать разницу в эффективности генной электропереноса, когда все импульсы поступают в том же направлении, или когда импульсы передаются путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентацию. Процент клеток, экспрессирующих GFP ген передается оценивали 24 часов после импульса приложений и увеличение успешной трансфекции клеток, когда импульсы были доставлены путем изменения альтернативно направления электрического поля и ориентации (выживаемость 80,8% ± STD 12%) по сравнению, когда все импульсы были доставлены в том же направлении (выживаемость 76% ± станд 16,2%) было получено.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана словенского агентства исследований (проект J2-9770, инфраструктурных IP-0510 центр и программы Р2-0249). Это видео представляет дополнительный материал для "Электропорация основе технологий и методов лечения" научно-практический семинар и аспирантуру, организованный факультет электротехники в университете Любляны, Словения. Авторы благодарят также DUSA Ходжич за любезно предоставленные плазмидной ДНК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
