Summary
Gene transfektion av elektroporation förbättras ungefär två gånger när orientering av elektriska fält ändras under pulsen ansökan, medan cellviabiliteten inte påverkas. Ökningen av genen transfektion orsakas av ökningen av membranet område som är gjord behörig för DNA in i cellen.
Abstract
Gene electrotransfer är en fysisk metod som används för att leverera gener in i cellerna genom tillämpning av korta och intensiva elektriska pulser, som orsakar destabilisering av cellmembranet, vilket gör det släpper igenom små molekyler och möjliggör överföring av stora molekyler som DNA. Det representerar ett alternativ till virala vektorer, på grund av dess säkerhet, effekt och enkel applikation. För genen electrotransfer olika elektrisk puls protokoll används för att uppnå maximal gen transfektion, en av dem håller på att förändras det elektriska fältet riktning och orientering under pulsen leverans. Ändra elektriska fältet riktning och orientering öka membranet området behöriga för DNA in i cellen. I denna video visar vi skillnaden i genen electrotransfer effekt när alla pulser levereras i samma riktning och när pulser levereras genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering. För detta ändamål spets med integrerad elektroder och högspännings-prototyp generator, som möjliggör byte av elektriska fält i olika riktningar under elektrisk puls ansökan, har använts. Gene electrotransfer effekt bestäms 24h efter puls ansökan som antalet celler som uttrycker grönt fluorescerande proteinet dividerat med antalet av alla celler. Resultaten visar att genen transfektion ökas när det elektriska fältet läggning under elektrisk puls leverans ändras.
Protocol
1. Cellodling, plasmid och buffert förberedelse för försöket
- I detta experiment kinesisk hamster celler (CHO-K1) används. Celler odlas i en näringslösning blandning HAM-F12 (PAA) kompletterat med 2 mm L-glutamin, 10% fetalt bovint serum, 400 l / l gentamicin (alla från Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Tyskland) och 1 ml / l crystacilin (Pliva, Zagreb, Kroatien). Cellerna hålls vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 atmosfär i inkubator för 24h.
- Förstärk plasmid pEGFP-N1 (Clontech Laboratories Inc., Mountain View, CA, USA) kodning grönt fluorescerande protein (GFP) i DH5α stam av Escherichia coli och isolera den med HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland). Plasmid-DNA koncentration (plasmid löst i TE buffert) bör spektrofotometriskt bestäms vid 260 nm och bekräftas med gelelektrofores.
- Förbered isoosmolar buffert natriumfosfat (10 mM Na 2 HPO 4, 10 mm NaH 2 PO 4, 1 mM MgCl 2, 250 mm sackaros, pH 7,4).
- På dagen av försöket förbereda cellsuspension av trypsinization med 0,25% trypsin / EDTA-lösning (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Deisenhofen, Tyskland). Centrifugera cellerna i 5 min vid 1000 rpm (180 xg) vid 4 ° C (Sigma, Tyskland) och resuspendera cellpelleten i isoosmolar natriumfosfat buffert för att en cell densitet på 5 × 10 6 celler / ml.
2. Hårdvara utrustning
- Celler utsätts för elektriska fältet i pipettspetsen (figur 1) med integrerad elektroder anslutna till en högspänd prototyp generator. Spetsen och elektroden geometri gör att tillämpningen av relativt homogena elektriska fält och generatorn kan leverera elektriska pulser i olika riktningar. Spetsen och generatorn har utvecklats vid laboratoriet för Biocybernetics, fakulteten för elektroteknik, universitetet i Ljubljana 1.
Figur 1. Vertikal och horisontell (a) tvärsnitt och fotografi (b) i pipettspetsen med integrerade elektroder. I tvärsnittet grå färgen används för plastkåpa och svart för elektroder. Pipettspetsen med integrerad elektroder består av fyra cylinderformad stång elektroder. Elektroderna är tillverkade av rostfritt stål, deras diameter är 1,4 mm, intill elektroderna är 1 mm från varandra, och mittemot elektroder är 2 mm från varandra. Elektroderna är limmade i plasten spetsen parallellt och deras tillämpliga längd är 30 mm 2.
3. Gene electrotransfer protokoll
- Lägg plasmid pEGFP-N1 till en cellsuspensionen i koncentration 10 mikrogram / ml.
- Inkubera blandningen i 2-3 minuter i rumstemperatur, innan elektriska pulser.
- Aspire 100 l cellsuspension i pipettspetsen med integrerade elektroder.
- För att uppnå bästa effekt gen electrotransfer och underhålla cellviabiliteten bör optimala parametrar för elektriska pulser användas. I detta experiment ett tåg av 8 rektangulära pulser (vardera med längd 1 ms, amplitud 225 V vid 1 Hz repetition frekvens) tillämpas på varje prov, med hjälp av högspänning prototyp generator. Två olika elektriskt fält protokoll (Figur 2) används: i det första protokollet alla pulser levereras i samma riktning, medan det i det andra protokollet pulser levereras genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering. Det andra protokollet kan endast användas med lämplig puls generator, som tillåter tillämpning av elektriska pulser i olika riktningar.
- Omedelbart efter pulsen ansökan överföra celler från pipettspetsen i 6 brunnar och lägga fetalt kalvserum (FCS-Sigma, USA) (25% av provvolym).
- Inkubera cellerna i 5 min vid 37 ° C så att omplombering cellmembranet.
- Tillsätt 2 ml HAM-F12 för att varje prov i 6 brunn och inkubera celler för 24 h vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 atmosfär i inkubatorn.
. Figur 2 Elektriska fält protokoll: (a) alla pulser levereras i samma riktning, är (b) pulser genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering.
4. Bild förvärv och bestämning av genen electrotransfer effekt
- Effekten av genen electrotransfer bestäms som den andel av celler som uttrycker GFP 24h efter pulsen ansökan.
- Cellerna observeras med hjälp av en fluorescensmikroskop (i vårt fall Zeiss 200, Axiovert, ZR Tyskland) med excitation ljus vid 488 nm genereras med en monokromator systemet (polykrom IV, Visitron, Tyskland) och utsläpp upptäcks på 507 nm. Bilderna spelas in med hjälp av imaging-system (metamorfa Imaging System, Visitrpå, Tyskland), men andra liknande förvärv programvara kan också användas.
- Skaffa minst fem bilder (faskontrast och grön fluorescens) på 20x objektiv förstoring.
- Räkna celler i faskontrast bild och celler som uttrycker GFP i grön fluorescens bild. Bestäm andel av genen electrotransfer effekt genom att dividera antalet celler som uttrycker GFP med antalet alla celler i varje motsvarande bild (Figur 3).
5. Representativa resultat:
Figur 3. Andelen celler som uttrycker GFP när alla pulser levereras i samma riktning och när pulser levereras genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering presenteras. Cellerna utsattes för ett tåg av åtta pulser med amplituden 225 V, längd 1 ms och upprepning frekvens av 1 Hz. Resultat erhölls med hjälp av fluorescensmikroskopi. Varje värde i diagrammet representerar medelvärdet av tre oberoende försök ± standardavvikelse. Genom att ändra det elektriska fältet riktning och orientering andelen celler som uttrycker GFP ökar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gene electrotransfer är en mångsidig bioteknik teknik som möjliggör överföring av DNA i celler genom att tillämpa korta, högspänning elektriska pulser 3 och är ett säkrare alternativ till virala vektorer på grund av dess säkerhet, effektivitet och enkel applikation. Även om dagens gen electrotransfer används ofta för att transfektera alla typer av celler och den första fas I klinisk studie med denna metod har rapporterats 4, är de bakomliggande mekanismerna ännu inte helt klarlagd. Det är känt, att tillämpningen av elektriska pulser av tillräcklig styrka för att cellen orsakar en ökning av det transmembrana potential, vilket inducerar membranet destabilisering 5. Cellmembranet permeabilitet ökar och i övrigt nonpermeant molekyler in i cellen. Många parametrar har beskrivits 6-9, som påverkar effekten av genen electrotransfer, särskilt tillämpningen av olika pulsparametrar studerades för att möjliggöra bättre genöverföring 10-12. Ändra det elektriska fältet riktning och orientering under pulsen leveransen ökar området i permeabilized cellmembranet 13 ökar därför behöriga utrymmet för överföring av DNA-molekyler. Det visade sig, att andelen celler som uttrycker överförda genen ökar när elektriska fältet riktning och orientering ändras under programmet 14. För detta ändamål elektrisk puls generator, som möjliggör tillämpning av elektriska pulser i olika riktningar måste användas 1. Vi använder sådana pulsgenerator och pipettspetsen med integrerade elektroder för att visa skillnaden i genen electrotransfer effekt, när alla pulser levereras i samma riktning eller när pulser levereras genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering. Andelen celler som uttrycker överförs GFP-genen bedömdes 24h efter puls ansökan och ökningen framgångsrikt transfekterade celler när pulserna levererades genom att ändra alternativt elektriska fältet riktning och orientering (överlevnad 80,8% ± std 12%) i jämförelse när alla pulser levererades i samma riktning (överlevnaden 76% ± std 16,2%) erhölls.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av det slovenska forskningsinstitut (projekt J2-9770, infrastrukturella centrum IP-0510 och program P2-0249). Denna video är kompletterande material för "elektroporation-baserade tekniker och behandlingar" vetenskapliga verkstad och magisterexamen, som anordnas av fakulteten för elektroteknik vid universitetet i Ljubljana, Slovenien. Författarna tackar också Duša Hodzic för snällt att ge plasmid-DNA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HAM-F12 | PAA Laboratories | E15-016 | culture medium |
| L-glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| fetal bovine serum | PAA Laboratories | A15-151 | |
| gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | antibiotic |
| crystacilin | Pliva | 625110 | antibiotic |
| pEGFP-N1 | Clontech Laboratories | 6085-1 | plasmid DNA |
| HiSpeed Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12662 | |
| Na2HPO4 | Merck & Co., Inc. | F640786 933 | |
| NaH2PO4 | TKI Hrastnik | 0795 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| sucrose | Sigma-Aldrich | 16104 | |
| trypsin/EDTA solution | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| pipette tip | Custom Made | ||
| electric pulse generator | Custom Made | ||
| 6 well plate | Techno Plastic Products | 92406 | |
| 15 ml centrifuge tube | Techno Plastic Products | 91015 | |
| 75 cm2 culture flask | Techno Plastic Products | 90076 |
References
- Rebersek, M. Electroporator with automatic change of electric field direction improves gene electrotransfer in-vitro. Biomed Eng Online. 6, 25-25 (2007).
- Trontelj, K., Rebersek, M., Miklavcic, D. Tip electrode chamber for small volume electroporation, electrofusion, and gene transfection. 18, (2006).
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1, 841-841 (1982).
- Daud, A. Phase I trial of interleukin-12 plasmid electroporation in patients with metastatic melanoma. J Clin Oncol. 26, 5896-5903 (2008).
- Pavlin, M., Miklavcic, D. Effective conductivity of a suspension of permeabilized cells: a theoretical analysis. Biophys J. 85, 719-729 (2003).
- Xie, T., Sun, L., Zhao, H., Fuchs, J., Tsong, T. Study of mechanisms of electric field-induced DNA transfection. IV. Effects of DNA topology on cell uptake and transfection efficiency. Biophys J. 63, 1026-1031 (1992).
- Rols, M., Delteil, C., Serin, G., Teissie, J. Temperature effects on electrotransfection of mammalian cells. Nucleic Acids Res. 22, 540-540 (1994).
- Golzio, M., Teissie, J., Rols, M. Cell synchronization effect on mammalian cell permeabilization and gene delivery by electric field. Biochim Biophys Acta. 1563, 23-28 (2002).
- Haberl, S., Miklavcic, D., Pavlin, M. Effect of Mg ions on efficiency of gene electrotransfer and on cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry. 79, 265-271 (2010).
- Rols, M., Teissie, J. Electropermeabilization of mammalian cells to macromolecules: control by pulse duration. Biophys J. 75, 1415-1423 (1998).
- Kanduser, M., Miklavcic, D., Pavlin, M. Mechanisms involved in gene electrotransfer using high-and low-voltage pulses-An in vitro study. Bioelectrochemistry. 74, 265-271 (2009).
- Pavlin, M., Flisar, K., Kanduser, M. The role of electrophoresis in gene electrotransfer. J Membr Biol. 236, 75-79 (2010).
- Sersa, G., Cemazar, M., Semrov, D., Miklavcic, D. Changing electrode orientation improves the efficacy of electrochemotherapy of solid tumors in mice. Bioelectrochem Bioenerg. 39, 61-66 (1996).
- Faurie, C. Electro-mediated gene transfer and expression are controlled by the life-time of DNA/membrane complex formation. J Gene Med. 12, 117-125 (2010).
