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Summary
我々は、その後、表面抗原（DotScan CRCマイクロアレイ）を認識するカスタマイズされた抗体のマイクロアレイ上に捕捉されている実行可能な単一の細胞を、生成するために大腸癌（CRC）の分解のために手順を説明した。マイクロアレイに結合した細胞のサブ集団は、蛍光色素でタグ付けされたモノクローナル抗体を用いた蛍光多重化によってプロファイル化することができます。
Abstract
CRCの現在の予後との分類は、病理組織学的および臨床所見を統合するシステムをステージングに依存しています。しかし、CRCのケースの大半で、細胞の機能不全は、蛋白質の発現と翻訳後修飾1を修正する多数の突然変異の結果である。
分化（CD）抗原のクラスターを含む細胞表面抗原、、の数は、CRCの潜在的な予後や転移性のバイオマーカーとして同定されている。これらの抗原は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および腫瘍関連マクロファージ（TAMS）のような他の細胞型で腫瘍の進行や相互作用とその発現しばしば変更、として理想的なバイオマーカーを作る。
癌のサブ分類と予後のための免疫組織化学（IHC）の使用はいくつかの腫瘍タイプ2,3のために確立されます。しかし、単一の"マーカーは、"臨床病理病期分類よりも大きな予後的意義を示していないか、すべてのCRCケースのルーチン病理報告で使用するために広く受け入れられています。
疾患の表現型の予後の層別化により最近のアプローチは、複数の"マーカー"を使用して表面のタンパク質プロファイルに依存しています。 such iTRAQとしてproteomic手法を用いて腫瘍の発現プロファイリングがbiomarkers4の発見のための強力なツールですが、それは検査室で日常的に使用するための最適ではありません及び混合集団で異なる種類の細胞を区別することはできません。さらに、腫瘍組織の大量のこれらの方法によって精製の細胞膜糖タンパク質のプロファイリングに必要とされています。
このビデオでは、DotScan CRCの抗体のマイクロアレイを用いた非集計CRCのサンプルから生細胞の表面にプロテオームのプロファイリングのためのシンプルな方法を説明した。 122 -抗体のマイクロアレイは、CRCのための40潜在的に予後マーカーの検出のための衛星地域と一緒に、系統特異的白血球マーカー、接着分子、受容体と炎症と免疫応答5のマーカーの範囲を認識し、標準の82 -抗体の地域で構成されています。細胞は、それらが対応する抗原を発現するための抗体に捕捉されています。光学走査によって決定されるドットあたりの細胞密度は、その抗原を発現する細胞の割合は、抗体6の抗原と親和性の発現のレベルを反映している。
CRCの組織または正常な腸の粘膜の場合は、光学スキャンは、細胞の混合集団の免疫表現型を反映している。蛍光多重化は、アレイ上に捕捉された目的の細胞の選択したサブ集団をプロファイルするために使用することができます。例えば、アレクサ647 -抗上皮細胞接着分子（EpCAM、CD326）は、フィコエリスリン、抗CD3、使用されている間、、CRC細胞とまた正常な腸粘膜の上皮細胞を検出するために使用されたパン上皮分化抗原であるT -細胞7浸潤を検出する。 DotScan CRCマイクロアレイは、解剖学的にベースのCRCのステージングシステムへの診断の代替のためのプロトタイプにする必要があります。
Protocol
CRCの手術標本からの生細胞の懸濁液の調製のための図1。作業の流れ。
1。臨床サンプルの分解
すべてのサンプルはプロトコルナンバーX08 - 164の下のインフォームドコンセントとロイヤルプリンスアルフレッド病院（キャンパー、NSW、オーストラリア）とコンコードの送還病院（コンコード西、NSW、オーストラリア）から採取された。
- 新鮮な大腸癌（CRC）または腺腫の標本、および正常な腸粘膜腫瘍から10cm以上を収集。切除後最大12時間で4ハンクス平衡塩溶液のpHは7.3（HBSS）° Cで保管してサンプル。
- 生物学的安全キャビネットクラスIIのすべての臨床サンプルを処理する、人間の病原体に対する安全規制に従ってください。 twoメス刃を用いてシャーレ内2mmの立方体にサンプルを分析する。
- 37℃で60分間、時折穏やかに混合しながら別のエッペンドルフチューブに腫瘍と正常組織をインキュベート℃で2％（v / v）のコラゲナーゼタイプ4（ワーシントン、レイクウッド、ニュージャージー州、米国）および0.1を含むRPMI 1640培地の等量とCウシpancreaseから％（w / v）のデオキシリボヌクレアーゼI（DNアーゼI、Sigma - Aldrich社）。
- 力を10mLのシリンジからプランジャーを用いて微細なワイヤーメッシュのストレーナを介して組織を半消化、HBSSによるを通して洗浄細胞。
- 細胞凝集体を除去するためには200μmと50μmのFilconフィルタ（BD Biosciences社）を介して得られた細胞懸濁液を渡します。 DNA、粘液や細胞凝集体のほとんどは、ろ過のこのシリーズでは削除されます。
- 5分間20℃で400 xgで細胞懸濁液を遠心してください。
- 10％のジメチルスルホキシド（DMSO）を含む熱不活化FCSに再懸濁し、細胞ペレットは、-80℃でcryovialsとストアに徐々に凍結する。凍結処理は、サンプル中の粘液を減少させる傾向があり、赤血球を溶解。
2。セルキャプチャ用のサンプル調製
- DMSOを洗い流すためにすぐにHBSSを10mLの37℃の水浴と再懸濁し、細胞のサンプルを解凍する。
- 5分間20℃で410 xgで細胞懸濁液を遠心してください。
- 上清をデカントし、HBSS500μlに細胞ペレットを再懸濁します。
- 0.1％（w / v）の室温で20分間DNase Iでサンプルを処理する。
- トリパンブルーを等量でそれぞれの細胞懸濁液の10μLを混合し、血球計数器に混合物10μLをロード。死細胞は色素を取る間、100倍の倍率で光学顕微鏡を使用して、、トリパンブルー排除による明確な表示、生細胞を、数える。最小4 × 10 6生存細胞をマイクロアレイ上での細胞のキャプチャに必要です。
- DNase処理に続いて、5分間20℃で410 × gで10 mLのHBSSと遠心機で細胞懸濁液を懸濁します。
- 200μLの最終容量にRPMI 1640で上清と再懸細胞ペレットをデカント。
3。抗体マイクロアレイのセルキャプチャ
- リン酸塩にニトロセルロースのセクションを浸漬することによりDotScan抗体マイクロアレイを湿らせ、約20秒間緩衝食塩水（PBS）慎重にニトロセルロースのセクションに触れて避け、折られたキムワイプでマイクロアレイのガラスのエッジを拭いてください。
- 湿度の高い部屋を提供するために、マイクロアレイのインキュベーショントレイに水を追加。チャンバーにマイクロアレイを置き、湿ったニトロセルロースセクションにRPMI 1640で細胞懸濁液をピペットで。ピペットでも細胞の広がりを確保するためにニトロセルロースの各コーナーにドロップします。
- 1時間、37℃でマイクロアレイをインキュベートインキュベーションは、細胞がマイクロアレイ上の抗体と接触して解決してくることができます。彼らはに着陸抗体に対応する表面抗原を発現する細胞がキャプチャされます。
- インキュベーション後、未結合の細胞を（洗浄あたり20秒）洗い流し少なくとも15 mLのPBSを備えた三谷に静かにして垂直にマイクロアレイをディップ。
- 架橋によって細胞と抗体を固定するためにPBS中3.7％（w / v）のホルムアルデヒドを準備します。ゆっくりとマイクロアレイのニトロセルロースのセクションをカバーするために約1 mLをピペットで。室温で20分間インキュベートする。
- 次ディップマイクロアレイPBS（15mLを、30秒ごと）の3変化に過剰なホルムアルデヒドを洗い流すこと。
- エッジとキムワイプでスライドガラスの裏面を拭くとDotScanスキャナの間を使用してマイクロアレイをスキャンする、ニトロセルロースのセクションでは、湿ったです。光学スキャンは、混合細胞集団、例えばCRC細胞、白血球や腫瘍の他の間質細胞の抗原の発現パターンが用意されています。
4。多重蛍光
- スキャナからマイクロアレイを削除し、ブロッキングバッファー（2％w / vのBSA、2％熱不活化ヒトAB血清、PBS、pH7.3）を200μLを適用します。 20分間室温でマイクロアレイトレイでそれをインキュベートする。
- multipを準備アルミ箔で覆われてエッペンドルフチューブにレクサーソリューション：20μLフィコエリスリン、抗CD3（ベックマンコールター、Gladesville、NSW、オーストラリア、＃IM12824、1/7.5最終希釈）、10μLのAlexa Fluor ® 647 -抗EpCAM（Biolegend、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国、1月15日希釈）、熱不活化ヒトAB血清（Sigma - Aldrich社、キャッスルヒル、NSW、オーストラリア）とブロッキングバッファー118μLの2μL。
- マイクロアレイから過剰なブロッキングバッファーを切ると均一に広がり、ニトロセルロースのセクションの上に多重化ソリューションをピペットで。室温で暗所で30分間インキュベートします。
- 15ミリリットル新鮮なPBSの三谷に垂直にマイクロアレイを浸し、（30秒ごと）。
- 4℃で暗所や店舗でマイクロアレイを乾燥させて·スライドボックスでC。マイクロアレイは、蛍光を損失することなく、最大3ヶ月間、暗所で保存することができます。
- 50（532 nmのレーザー、PEの580 BP30発光フィルター。633nmのレーザーとAlexa 647のための670 BP30エミッションフィルタ）に設定された解像度で台風FLA 9000スキャナ（GEヘルスケア、Rydalmere、NSW、オーストラリア）を使用して乾燥したマイクロアレイをスキャン。マイクロアレイは、ガラスのスキャナのトレイ上に下向きにニトロセルロース側でスキャンされます。
- 17にTIFFファイルのような蛍光画像と使用してPhotoshopのセットの画像サイズを保存する× 25センチ、解像度72ピクセル/ cmまで。ドットの強さを分析するDotScan解析ソフトウェアに画像をインポートします。
- DotReaderは、ドットの結合パターンのデジタル画像をキャプチャし、8ビットのgreynessのスケール上の各抗体のドット（1〜256 U）の細胞結合の密度を定量化する。時折以外の特定のアイソタイプコントロールのバインディングは、対応する免疫グロブリンのアイソタイプを持つ抗体の結合値から差し引かれた。各マイクロアレイ用ドット蛍光強度は100％の強度で設定された明るいドットに対して正規化された。信号/スポット強度。xmlファイル（生データ）に記録されているか。pdfファイル（最終報告）の棒グラフで表された
- マイクロアレイheatsmapsと階層的クラスタリングは、TM4マイクロアレイソフトウェアスイート（から複数実験ビューア（MeV）のバージョン4.4を使用して行ったhttp://www.tm4.org/mev.html ）。階層的クラスタリングは、完全な連鎖解析と中性子を用いてバックグラウンド調整データに基づいて行った。ユークリッド距離を類似度のために使用されていました。等分散の2 -スチューデントのt検定は、結果の統計的有意性を決定するために使用された。
5。代表的な結果：
DotScanのマイクロアレイの結果から、重複して配列の間で一貫性のある細胞の結合パターンを示す必要があります。強力なアラインメントドット結合（CD44/CD29）は、配列の領域にわたって配置されるグリッドが可能になります。図2は、最適なセルのキャプチャと多重化の例を示しています。図3は、細胞の捕獲と考えられる解決中に発生するいくつかの一般的な問題を示しています。
マイクロアレイのセルの結合の結果は、1から256までgreynessの尺度で表現ドット強度を測定することによって定量することができます。図4は、階層的クラスタリングとヒートマップとしてEpCAM -アレクサ647抗体で染色した58外科CRCのサンプルから数値データを、示しています。サンプル数が限られているにもかかわらず、同じステージのCRCは同じグループ内のクラスタに傾向がある。
図2。臨床大腸癌の腫瘍（オーストラリアクリニック-病理学的病期分類、ACPステージB1）のセルの結合パターン。重複してマイクロアレイ（概説）の左半分のために抗体の位置を示す（A）DotScanの抗体のキー。上部のセクションでは、DotScan白血病のマイクロアレイのオリジナル82抗体が含まれています。特定の表面抗原に対応する追加40抗体は、CRC"衛星"マイクロアレイとして追加され、文献でアップレギュレートであることがわかった。下のセクションでは、アイソタイプコントロール抗体マイクロアレイへの結合CRC細胞の（b）光のイメージで構成されています。 T -細胞を示す（C）CD3蛍光画像。 CRC細胞を示す（d）はEpCAM蛍光イメージ。
図3。貧しいDotScan結果と可能な解決策の例。 （a）低細胞結合、解決策は：、：最小化するためにマイクロアレイ上でインキュベーションする前に、サンプルに熱不活化ヒトAB血清を追加するソリューション少なくとも4x106生存細胞は、（b）に結合アイソタイプコントロールのバインドと非特定のセルが配列上にあることを確認してくださいアイソタイプコントロールのバインド。時折、ニトロセルロースへの細胞の非特異的結合の少量は、CRCのサンプルで発生し、大きく結果には影響しません。 （C）ニトロセルロースは、インキュベーション中に乾燥、溶液：試料が全体のニトロセルロースのセクションをカバーし、マイクロアレイは、平らな表面上でインキュベートされていることを確認します。 （d）高バックグラウンドのアーティファクト。ソリューション：確認してくださいマイクロアレイは、徹底的に、以下のインキュベーションを洗浄する。
図4。DotScan解析ソフトウェアは、1から256までgreynessスケールでの細胞結合密度を表す棒グラフを生成した。軸上の数字は、CD抗原を参照してください。 κ、λ、免疫グロブリン軽鎖; SIG、表面免疫グロブリン、DCC、大腸癌の蛋白質で削除、EGFR、上皮成長因子受容体、FAP、線維芽細胞活性化タンパク質、HLA - A、B、他の略語は、TCR、T細胞受容体です。 、B、CをそれぞれC、HLA - DR、ヒト白血球抗原DRと、MICA、MHCクラスI鎖関連タンパク質、MMP - 14、行列のmetallopeptidase 14; PIGR、高分子免疫グロブリン受容体、TSP - 1、トロンボスポンジン-1;役割を持つ、ヒト化抗CD20。 拡大画像を表示するにはここをクリック 。
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Discussion
このビデオでは、我々はDotScan抗体のマイクロアレイは、CRCの組織からの細胞集団のために表面抗原のプロファイルを研究するために、単純な、半定量的な方法で使用することができる方法を示します。
エネルギー依存性のプロセス（例えば、キャッピング抗原および/または偽足形成が）、インキュベーション中の抗体のドットの全細胞の強固な結合に必要であるように見えるので、組織から実行可能な単一の細胞懸濁液を得ることは、実験の成功に不可欠です。死んだ細胞は、その後洗い流されている間。 1型コラゲナーゼは、最初に組織disaggregation8に用いられたが、それはより少ないプロテアーゼの汚染物質が含まれているように、細胞膜にはあまりダメージを引き起こすコラゲナーゼを4で置き換えられました。この変更は、細胞収率、生存率や結合パターンに影響を与えなかった。いくつかの腫瘍と対照試料からの粘液は細胞収率を減少させ、細胞の取り込みを妨害。粘液のこの粘りは、9を凍結融解後の粘液の性質の変化におそらく原因で、-80℃で10％DMSO / FCSで分解された細胞懸濁液° Cの貯蔵によって最小化された。その後、すべてのサンプルが分解した後、10％DMSO / FCSで凍結保存され、急速に一貫性のある結合パターンで、生存細胞の懸濁液を生成するために解凍した。 <50％の生存率やアライメント/ハウスキーピングドット（CD44/CD29）で貧しい人々の結合を示す検体は、分析から除外した。
コンフォメーションの変化が原因の可能性ニトロセルロース、などにバインドするときにいくつかの抗体のクローンが減少親和性を示し、顕著なCRCのマーカーCD15sは非常にほとんどあるいはまったく細胞結合を持っていた。一貫して否定的な結果を示した抗体は異なるハイブリドーマのクローンで置き換える必要があります。いくつかの抗体の貧しい人々の活動のもう一つの原因としては、ウシ血清アルブミン（BSA）による結合に干渉した。可能であれば、BSAを含まない抗体マイクロアレイに使用する必要があります。
大規模な患者のコホートはマイクロアレイデータの統計分析、我々の結果の階層的クラスタリング（58臨床サンプル）が必要であるが、奨励されています。ヤン10で説明したアプローチを使用してデータの正規化は、改善された統計的有意性を提供する必要があります。
DotScan抗体マイクロアレイが知られているCD抗原の発現の新たなパターンの測定を可能にしながら、2次元ゲル電気泳動やLC - iTRAQ - MSなどのプロテオミクス発見技術、と組み合わせて使用すると、それは小説差豊富なタンパク質を同定するために、最も効果的です。 。このような新規タンパク質は、潜在的なマーカーであり、対応する抗体は、配列に追加され、臨床CRCのサンプルで検証することができます。
キャプチャされたセルのサブ集合をプロファイルするために蛍光標識抗体の使用は、細胞の混合集団の分析のための強力なDotScanプラットフォームを提供します。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は、CRCと正常な腸粘膜の新鮮なサンプルを収集するためのロイヤルプリンスアルフレッドとコンコードの送還病院の解剖学的病理学研究所のスタッフに感謝。仕事は癌研究所ニューサウスウェールズ州トランスレーショナルプログラムの助成金によって賄われていた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington Biochemical | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo Medical Corp. | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 µm) | Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603 | |
| Fetal calf serum | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon Instruments | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner Bio-One | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalge Nunc international | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark Corporation | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phyc–rythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter Inc. | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
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Tags
免疫学、問題55、大腸癌、白血球、抗体マイクロアレイ、多重化、蛍光、CD抗原Erratum
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 07/03/2015.
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The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
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