Kolorektal cancer cellytan Proteinprofilering Använda en antikropp microarray och fluorescens Multiplexing

Summary

Vi beskrev ett förfarande för uppdelning av kolorektal cancer (CRC) för att producera livskraftiga enskilda celler, som sedan fångas på skräddarsydda antikroppar microarrays erkänna ytantigener (DotScan CRC microarray). Sub-populationer av celler bundna till microarray kan profileras med fluorescens multiplexering använda monoklonala antikroppar märkta med fluorescerande färger.

Abstract

Den nuvarande prognosen och klassificeringen av CRC är beroende av iscensättningen system som integrerar histopatologiska och kliniska fynd. Men i de flesta av CRC fall är cellsdysfunktion resultatet av många mutationer som modifierar protein uttryck och post-translationell modifiering ^1.

Ett antal av antigener på cellytan, däribland kluster av differentiering (CD) antigener, har identifierats som potentiella prognostiska eller metastaserad biomarkörer i barnkonventionen. Dessa antigener gör idealisk biomarkörer som deras uttryck som ofta förändras med tumörprogression eller interaktioner med andra celltyper, såsom tumör-infiltrera lymfocyter (TILs) och tumör-associerade makrofager (TAMs).

Användningen av immunohistokemi (IHC) för cancer sub-klassificering och prognostisering är väl etablerad för vissa tumörtyper ^2,3. Dock har ingen enda "markör" visas prognostisk betydelse är större än klinisk-patologisk staging eller vunnit stor acceptans för användning i rutinmässig patologi rapportering av alla CRC fall.

En nyare metod för prognostiska skiktning av sjukdom fenotyper bygger på profiler ytprotein använder flera "markörer". Medan expression profiling av tumörer med hjälp av proteomik tekniker såsom iTRAQ är ett kraftfullt verktyg för upptäckten av biomarkers4 är det inte optimalt för rutinmässig användning i diagnostiska laboratorier och kan inte skilja olika celltyper i en blandad befolkning. Dessutom finns stora mängder tumörvävnad krävs för profilering av renat glykoproteiner plasmamembranet av dessa metoder.

I denna video har vi beskrivit en enkel metod för utanpåliggande proteom profilering av livskraftiga celler från uppdelad CRC prover med en DotScan CRC antikropp microarray. Den 122-antikropp microarray består av en standard 82-antikropp regionen att erkänna en rad släkt-specifika leukocyter markörer, adhesionsmolekyler, receptorer och markörer för inflammation och immunsvar ^5, tillsammans med en satellit region för detektion av 40 potentiellt prognostiska markörer för CRC . Celler fångas endast på antikroppar som de uttrycker motsvarande antigen. Den celltäthet per punkt, bestäms av optisk avläsning, återspeglar andelen celler som uttrycker att antigen, nivån av uttryck av antigen och affinitet av antikroppen ^6.

För CRC vävnad eller normala tarmslemhinnan, optiska skannar återspeglar immunofenotyp av blandade populationer av celler. Fluorescens multiplexering kan sedan användas för att profilera utvalda sub-populationer av celler av intresse fångas på matrisen. Till exempel Alexa 647-anti-epitelceller celladhesionsmolekyl (EpCAM, CD326) är en pan-epitelial differentiering antigen som användes för att upptäcka barnkonventionen celler och även epitelceller av normal tarmslemhinnan, medan Phycoerythrin-anti-CD3, användes att upptäcka infiltrera T-celler ^7. Den DotScan CRC microarray bör vara prototyp för ett diagnostiskt alternativ till de anatomiskt baserade CRC staging system.

Protocol

Figur 1. Arbetsgång för beredning av en suspension av levande celler från en kirurgisk urval av CRC.

1. Kliniska prov uppdelning

Alla prover samlades in från Royal Prince Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Australien) och Concord Hemsändning Sjukhus (Concord West, NSW, Australien) med informerat samtycke enligt protokoll nr X08-164.

1. Samla färska kolorektal cancer (CRC) eller adenom prover, och normala tarmslemhinnan minst 10 cm från tumören. Förvara proverna i Hanks balanserade saltlösning pH 7,3 (HBSS) vid 4 ° C i upp till 12 timmar efter resektion.
2. Följ säkerhetsföreskrifterna för mänskliga patogener, bearbeta alla kliniska prover i ett biologiskt säkerhetsskåp klass II. Dissekera proverna i 2 mm kuber i en petriskål med två skalpell blad.
3. Inkubera tumör och normal vävnad i separata Eppendorf-rör med enstaka varsam blandning i 60 minuter vid 37 ° C med en lika stor volym RPMI 1640 medium som innehåller 2% (v / v) kollagenas typ 4 (Worthington, Lakewood, NJ, USA) och 0,1 % (w / v) deoxyribonukleas jag från nötkreatur pancrease (DNAse jag, Sigma-Aldrich).
4. Force semi-smälta vävnad genom ett fint trådnät sil med hjälp av en kolv från en 10 ml spruta, tvätta cellerna igenom med HBSS.
5. Pass resulterar cellsuspension genom 200 ìm och 50 ìm filter Filcon (BD Biosciences) för att ta bort cellaggregat. De flesta av DNA, slem och cellaggregat tas bort i denna serie av filtreringar.
6. Centrifugera cellsuspensioner vid 400 xgi 20 ° i 5 min.
7. Resuspendera cell pellets i värmeinaktiveras FCS innehåller 10% dimetylsulfoxid (DMSO), frysa långsamt i cryovials och förvara vid -80 °. Infrysningsprocessen tenderar att minska slem i provet och lyserar röda blodkroppar.

2. Provberedning för cell fånga

1. Tina upp prover snabbt i 37 ° vattenbad och återsuspendera cellerna i 10 ml HBSS att tvätta ut DMSO.
2. Centrifugera cellsuspensioner vid 410 xg vid 20 ° i 5 min.
3. Dekantera supernatanten och resuspendera cellpelleten i 500 mikroliter av HBSS.
4. Behandla provet med 0,1% (w / v) DNAse jag i 20 minuter vid rumstemperatur.
5. Blanda 10 mikroliter av varje cellsuspension med en lika stor volym trypan blå och belastning 10 mikroliter av blandningen i en hemocytometer. Använda ett ljusmikroskop vid 100-faldig förstoring, räkna livskraftiga celler, som är klar på grund av trypan blå utslagning, samtidigt som döda celler tar upp färgen. Minst 4 x 10 ⁶ livskraftiga celler krävs för cell fånga på microarray.
6. Efter DNAse behandling, resuspendera cellsuspensionen i 10 ml HBSS och centrifugera vid 410 xg vid 20 ° i 5 min.
7. Dekantera den supernatanterna och återsuspendera pellets cell i RPMI 1640 till en slutlig volym på 200 mikroliter.

3. Antikropp microarray cell fånga

1. Fukta DotScan antikropp microarray genom att doppa nitrocellulosa avsnittet i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för ca 20 s. Torka försiktigt av glaset kanter microarray med knäppta Kimwipes, undvika att röra vid nitrocellulosa sektionen.
2. Tillsätt vatten till microarray inkubationen fack för att ge en fuktig kammare. Placera microarray in i kammaren och pipettera cellsuspensionen i RPMI 1640 på den fuktiga nitrocellulosa avsnitt. Pipettera droppar på varje hörn av nitrocellulosa att säkerställa en jämn spridning av celler.
3. Inkubera microarrays vid 37 ° C under 1 h. Inkubationen en cell ska bosätta sig och komma i kontakt med antikroppar på microarray. Celler som uttrycker ytantigener motsvarar de antikroppar de landar på kommer att fångas.
4. Efter inkubation, doppa microarrays försiktigt och vertikalt i tre dalar som innehåller minst 15 ml PBS för att tvätta bort obundna celler (20 s per tvätt).
5. Bered 3,7% (w / v) formaldehyd i PBS för att fixera celler och antikroppar genom tvärbindning. Försiktigt pipettera ca 1 ml för att täcka nitrocellulosa delen av microarray. Inkubera 20 minuter vid rumstemperatur.
6. Nästa dopp microarrays i 3 förändringar av PBS (15 ml, 30 s vardera) att tvätta bort överskottet formaldehyd.
7. Torka av kanterna och baksidan av glaset bilden med Kimwipes och skanna microarray med DotScan scannern när är nitrocellulosa avsnittet fuktig. Den optiska skanningen ger mönstret antigen uttryck för en blandad t.ex. cellpopulation CRC celler, leukocyter och andra stromaceller av tumören.

4. Fluorescens multiplexering

1. Ta bort microarray från skannern och tillämpa 200 mikroliter blockerande buffert (2% w / v BSA, 2% värmeinaktiveras mänskliga AB-serum, PBS, pH 7,3). Inkubera det i microarray facket vid rumstemperatur i 20 min.
2. Förbered multiplexing lösning i ett Eppendorf-rör täckt med aluminiumfolie: 20 mikroliter Phycoerythrin-anti-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, NSW, Australien, # IM12824; 1/7.5 sista utspädning), 10 mikroliter Alexa Fluor 647-anti-EpCAM (Biolegend, San Diego, CA, USA, 1 / 15 utspädning), 2 mikroliter av värmeinaktiveras humant AB-serum (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australien) och 118 mikroliter blockerande buffert.
3. Tappa bort överflödig blockeringsbuffert från microarray och pipettera multiplexing lösningen på nitrocellulosa avsnittet sprider jämnt. Inkubera i 30 minuter i mörker vid rumstemperatur.
4. Doppa microarray vertikalt i tre dalar 15 ml färsk PBS, (30 s vardera).
5. Låt microarrays torka i mörker och förvara vid 4 ° C i en bild låda. Den microarray kan förvaras i mörker i upp till 3 månader utan förlust av fluorescens.
6. Skanna torra microarray med en Typhoon FLA 9000 skanner (GE Healthcare, Rydalmere, NSW, Australien) med upplösningen inställd på 50 (532 nm laser, 580 BP30 utsläpp filter för PE. 633 nm laser och 670 BP30 utsläpp filter för Alexa 647). Den microarrays skannas med nitrocellulosa vänd nedåt på glaset scannern facket.
7. Spara fluorescerande bilder som TIFF-filer och använda Photoshop som bildstorlek på 17 x 25 cm och upplösningen till 72 pixlar / cm. Importera bilden i DotScan analysprogram att analysera intensitet prickar.
8. Den DotReader fångar en digital bild av dot bindande mönstret och kvantifierar tätheten av cellen bindande för varje antikropp prick på en 8-bitars gråhet skala (1-256 U). Enstaka icke-specifik isotypisk kontroll bindning var subtraheras från bindande värden för antikroppar med motsvarande immunglobulin isotyper. Dot fluorescens intensiteter för varje microarray normaliserades mot den ljusaste punkten på 100% intensitet. Signal / plats styrka var in i en. Xml-fil (rådata) eller framställs som ett stapeldiagram i en. Pdf-fil (slutrapport)
9. Microarray heatsmaps och hierarkisk klustring genomfördes med hjälp av MultiExperiment Viewer (MeV) version 4,4 från TM4 Microarray Software Suite ( http://www.tm4.org/mev.html ). Hierarkisk klustring utfördes på bakgrund-justerade data med hjälp av MeV med komplett kopplingsanalys. Euklidisk distans användes för likhet åtgärd. Den 2-tailed Students t-test med lika varians användes för att fastställa den statistiska signifikansen av resultaten.

5. Representativa resultat:

Resultat från DotScan microarray ska visa konsekvent cell bindande mönster mellan dubbla arrayer. Starka anpassning dot bindande (CD44/CD29) gör ett rutnät som placeras över matrisen området. Figur 2 visar ett exempel på optimal cell fånga och multiplexering. Figur 3 visar några vanliga problem som uppstått under cellen fånga och möjliga lösningar.

Den microarray cellen bindande resultat kan kvantifieras genom att mäta prick stödnivåerna på en gråhet skala från 1 till 256. Figur 4 visar numeriska data från 58 kirurgiska CRC prover, färgats med EpCAM-Alexa 647 antikropp, som en heatmap med hierarkisk klustring. Även om antalet prov är begränsat, CRC i samma skede tenderar att koncentreras till samma grupp.

Figur 2. Cell bindande mönster av kliniska kolorektal cancer tumör (Australian Clinic-patologiska Staging, AVS stadium B1). (A) DotScan antikropp nyckel som visar placering av antikroppar för den vänstra halvan av de dubbla microarray (beskrivs). Den övre delen innehåller de ursprungliga 82 antikropparna av DotScan leukemi microarray. En ytterligare 40 antikroppar, som motsvarar särskilda ytantigener visat sig vara upp-reglerade i litteraturen, lades till som en CRC "Satellit" microarray. Den nedre delen består av isotypisk kontroll antikroppar (b) Optisk bild av CRC celler bindning till microarray. (C) CD3 fluorescens bild som visar T-celler. (D) EpCAM fluorescens bild som visar CRC celler.

Figur 3. Exempel på dålig DotScan resultat och möjliga lösningar. (A) Låg cell bindande, Lösning: Kontrollera att minst 4x106 livskraftiga celler på matrisen (b) isotypisk kontroll bindande och icke-specifik cell bindande, lösning: lägg värmeinaktiveras mänskliga AB-serum för att prova innan inkubering på microarray att minimera isotypisk kontroll bindande. Ibland förekommer en liten mängd av icke-specifik bindning av celler till nitrocellulosa med CRC prover och inte signifikant påverkar resultaten. (C) Nitrocellulosa uttorkning under inkubationen, lösning: se till att provet omfattar hela nitrocellulosa sektionen och microarray inkuberas på ett plant underlag. (D) hög bakgrund artefakter, lösning: se till attmicroarray är noggrant tvättas efter inkubation.

Figur 4. DotScan analysprogram genereras stapeldiagram som representerar cell bindande tätheter på en gråhet skala från 1 till 256. Siffror på axeln hänvisar till CD-antigener. Andra förkortningar är TCR, T-cell receptorn, κ, λ, immunoglobulin lätta kedjor, SIG, yta immunglobulin, DCC, tas bort vid kolorektalcancer protein, EGFR, epidermal growth factor receptor, FAP, fibroblast aktivering protein, HLA-A, B, C HLA-DR, mänskliga leukocytantigener DR och A, B, C respektive; glimmer, MHC klass I-kedjan-related protein A, MMP-14, matris metallopeptidase 14, PIGR, polymera immunglobulin receptor, TSP-1, thrombospondin-1; Mabthera, humaniserad anti-CD20. Klicka här för att visa större bild .

Discussion

I denna video visar vi hur DotScan antikropp microarray kan användas i en enkel, semi-kvantitativa sätt att studera profiler ytantigen för cellpopulationer från CRC vävnad.

Skaffa en livskraftig enda cell avstängning från vävnad är avgörande för framgång i försöket, eftersom energi-beroende processer (t ex, antigen ett tak och / eller pseudopodia bildning) verkar krävas för fasta bindning av hela celler till antikropp prickar under inkubationen, samtidigt som döda celler därefter tvättas bort. Typ 1 kollagenas början var anställd för vävnad disaggregation8, men ersattes med kollagenas 4 som orsakar mindre skador på cellmembran, eftersom den innehåller färre proteas föroreningar. Denna förändring påverkade inte cellen avkastning, livskraft eller bindande mönster. Slem från vissa tumörer och kontrollprover minskas cell avkastning och störde cell fånga. Denna klibbighet av slem var minimeras genom lagring av uppdelade cellsuspensionen i 10% DMSO / FCS vid -80 ° C, vilket förmodligen beror på förändringar i slem egenskaper efter frysning och upptining ^9. Därefter var alla prover förvaras frysta i 10% DMSO / FCS efter nedbrytning och var snabbt tinas att producera livskraftiga cellsuspensioner, med konsekvent bindande mönster. Prover med <50% livskraft eller visar dålig bindande för anpassning / städning punkter (CD44/CD29) har utelämnats från analysen.

Några antikroppar kloner visade minskad affinitet då bunden till nitrocellulosa kan bero på en förändring i konformation, till exempel, hade den framstående barnkonventionen markör CD15s mycket liten eller ingen cell bindande. Antikroppar som uppvisade genomgående uppvisar negativa resultat bör ersättas med olika hybridom kloner. En annan möjlig orsak till dålig aktivitet av vissa antikroppar var en störning till bindande av bovint serumalbumin (BSA). BSA-fria antikroppar bör användas på microarray där så är möjligt.

Även om stora patientgrupper kohorter krävs för statistisk analys av microarray data, hierarkiska kluster av våra resultat (58 kliniska prover) har varit uppmuntrande. Normalisering av data med hjälp av metoder som beskrivs av Yang ¹⁰ bör ge bättre statistisk signifikans.

Medan DotScan antikropp microarray möjliggör bestämning av nya mönster av uttryck av kända CD-antigener, det är mest effektiv när den används i kombination med proteomik upptäckten tekniker, såsom 2-dimensionell gelelektrofores och LC-iTRAQ-MS, för att identifiera nya differentiellt rikliga proteiner . Sådana nya proteiner är potentiella markörer, motsvarande antikropparna skulle kunna läggas till i arrayen, och valideras med kliniska CRC prover.

Användningen av fluorescerande-märkta antikroppar till profil sub-uppsättningar fångade celler ger en kraftfull DotScan plattform för analys av blandade populationer av celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hanks’ balanced salt solution	Sigma-Aldrich	H6136-10X1L	Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II	Westinghouse	1687-2340/612
Surgical blades	Livingstone	090609	Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes	Sigma-Aldrich	R4130-10X1L
Collagenase type 4	Worthington Biochemical	4188
Deoxyribonuclease 1	Sigma-Aldrich	DN25-1G
Terumo Syringe (10 mL)	Terumo Medical Corp.	SS+10L	Box of 100
Filcon filter (200 μm)	BD Biosciences	340615
Filcon filter (50 μm)	Filcon filter (50 µm)	Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603
Fetal calf serum	GIBCO, by Life Technologies	10099-141
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	7017
Dimethyl sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650
Trypan blue	Sigma-Aldrich	T8154
Hemocymeter Technocolor Neubar	Hirschmann	not available
Light microscope	Nikon Instruments	Nikon TMS
Cyrovial tubes	Greiner Bio-One	121278
Cryo freezing contrainer	Nalge Nunc international	5100-0001
DotScan antibody microarray kit	Medsaic	not available
DotScan microarray wash tray	Medsaic	not available
KimWipes	Kimberly-Clark Corporation	4103
Formaldehyde 37%	Sigma-Aldrich	F1635-500ML
DotReaderTM	Medsaic	not available
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418-10G
Heat-inactivated AB serum 2%	Invitrogen	34005100
Phyc–rythrin-conjugated CD3	Beckman Coulter Inc.	ET386
AlexaFluor647-conjugated EpCAM	BioLegend	324212
Typhoon FLA 9000	GE Healthcare	28-9558-08	532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4	TM4 Microarray Software Suite	Open – source software (Ref 11)