ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …
Summary
Мы описали процедуру разбивки колоректального рака (КРР) для получения жизнеспособных отдельных клеток, которые затем захвачен на индивидуальные микрочипов антител признании поверхностных антигенов (DotScan CRC микрочипов). Суб-популяции клеток, связанных с микрочипов можно профилировать по флуоресценции мультиплексирования с использованием моноклональных антител помеченные флуоресцентными красителями.
Protocol
Рисунок 1. Набор операций для приготовления суспензии живых клеток от хирургического образца о правах ребенка.
1. Клинический пример разбивки
Все образцы были собраны из Королевской больницы Принца Альфреда (Camperdown, Новый Южный Уэльс, Австралия) и Согласия Репатриация больница (Конкорд Запад, Новый Южный Уэльс, Австралия) с информированного согласия соответствии с Протоколом № X08-164.
- Сбор свежих колоректального рака (КРР) или аденома образцов, а нормальная слизистая оболочка кишечника не менее 10 см от опухоли. Магазин образцов в сбалансированный солевой раствор Хэнка рН 7,3 (HBSS) при 4 ° С в течение 12 ч после резекции.
- Следуйте правилам безопасности для человека микроорганизмов, процесс всех клинических образцов в кабинете биологической безопасности класса II. Рассеките образцов в 2 мм кубов в чашке Петри с помощью двух скальпель лезвий.
- Инкубируйте опухоли и нормальной ткани в отдельных труб Эппендорф с редкими нежными смешивания в течение 60 мин при 37 ° С с равным объемом RPMI 1640, содержащей 2% (объем / объем) коллагеназы типа 4 (Уортингтон, Лейквуд, штат Нью-Джерси, США) и 0,1 % (м / о) дезоксирибонуклеазы я из бычьего pancrease (ДНКазы I; Sigma-Aldrich).
- Группа полу-переваренной ткани через сито с мелкими отверстиями проволоки использованием плунжера из 10 мл шприца; мыть клетки через с HBSS.
- Pass результате клеточной суспензии через 200 мкм и 50 мкм фильтры Filcon (BD Biosciences) для удаления клеточных агрегатов. Большинство ДНК, слизи и клеточных агрегатов удаляются в этой серии фильтрации.
- Центрифуга клеточные суспензии, при 400 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
- Ресуспендируют гранулы ячейку в тепло инактивированной ФТС, содержащей 10% диметилсульфоксида (ДМСО), замораживание медленно криопробирки и хранить при температуре -80 °. Замораживание процесса ведет к снижению слизи в образце и лизирует эритроциты.
2. Подготовка образцов для сотовых захвата
- Оттепель из образцов быстро в 37 ° водяной бане и ресуспендирования клеток в 10 мл HBSS промыть ДМСО.
- Центрифуга клеточные суспензии, при 410 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
- Декантируйте супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл HBSS.
- Лечить образца с 0,1% (м / о) ДНКазы я в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Смешать по 10 мкл каждой клеточной суспензии с равным объемом трипанового синий и нагрузка 10 мкл смеси в гемоцитометра. Использование светового микроскопа при 100-кратным увеличением, граф жизнеспособных клеток, которые появляются в связи с ясно трипанового синего исключения, в то время как мертвые клетки занимают красителя. Не менее 4-х 10 6 жизнеспособных клеток требуется для сотовых захвата на микрочипов.
- После лечения ДНКазы, ресуспендируют клеточной суспензии в 10 мл HBSS и центрифуге при 410 мкг при 20 ° в течение 5 мин.
- Декантируйте супернатанты и ресуспендируйте гранулы ячейку в RPMI 1640 до конечного объема 200 мкл.
3. Антитела микрочипов ячейке захвата
- Смочите DotScan микрочипов антител путем погружения нитроцеллюлозы в разделе фосфатным буферным раствором (PBS) в течение примерно 20 секунд Аккуратно протрите стекла края микрочипов со сложенными Kimwipes, избегая касания нитроцеллюлозы разделе.
- Добавьте воду в лоток инкубации микрочипов обеспечить влажной камере. Место микрочипов в камеру и пипетки суспензии клеток в RPMI 1640 на влажном разделе нитроцеллюлозы. Внесите капель на каждом углу нитроцеллюлозы для обеспечения равномерного распределения клеток.
- Инкубируйте микрочипов при 37 ° С в течение 1 ч. Инкубационный позволяет клеткам для проведения расчетов и вступают в контакт с антителами на микрочипов. Клетки, экспрессирующие поверхностные антигены соответствующих антител, они приземляются на будет в плен.
- После инкубации, окуните микрочипов мягко и по вертикали на три желоба содержащих не менее 15 мл PBS, чтобы смыть несвязанных клетки (20 с на мытье).
- Подготовка 3,7% (м / о) формальдегида в PBS исправить клетки и антитела путем сшивания. Аккуратно пипеткой примерно 1 мл на покрытие нитроцеллюлозы разделе микрочипов. Инкубируйте в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Следующее падение микрочипов на 3 изменений PBS (15 мл, 30 с каждого), чтобы смыть избыток формальдегида.
- Протрите края и задней стекло с Kimwipes и сканирования микрочипов использованием DotScan в то время как сканер, нитроцеллюлозы разделе влажная. Оптического сканирования дает картину экспрессии антигенов смешанной популяции клеток, например, клетки КПР, лейкоцитов и других стромальных клеток опухоли.
4. Флуоресценция мультиплексирования
- Удалить микрочипов от сканера и применять 200 мкл блокирующего буфера (2% вес / BSA, 2% тепла человеческого инактивированной сыворотки АВ, PBS, рН 7,3). Выдержите его в лоток микрочипов при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Подготовка multipлексический раствора в пробирку Эппендорфа покрыта алюминиевой фольгой: 20 мкл фикоэритрин-анти-CD3 (Beckman Coulter, Gladesville, Новый Южный Уэльс, Австралия, # IM12824; 1/7.5 конечное разведение), 10 мкл Alexa Fluor 647-анти-EpCam (Biolegend, Сан - Диего, Калифорния, США; 1 / 15 разбавления), 2 мкл тепла инактивированной человеческой сыворотки АВ (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Австралия) и 118 мкл блокирующего буфера.
- Слить избыток блокирующий буфер из микрочипов и пипетки мультиплексирования раствор на нитроцеллюлозные разделе, распространяясь равномерно. Инкубируйте в течение 30 минут в темном месте при комнатной температуре.
- Dip микрочипов по вертикали на три желоба 15 мл свежего PBS; (30 с каждого).
- Пусть микрочипов сухой в темноте и хранить при 4 ° С в режиме слайд-коробки. Микрочипов может храниться в темноте в течение 3 месяцев без потери флуоресценции.
- Сканирование сухой микрочипов использованием Тайфун FLA-9000 сканер (GE Healthcare, Rydalmere, Новый Южный Уэльс, Австралия) с разрешением равным 50 (532 нм, 580 BP30 выбросов фильтр для PE. 633 лазерных нм и 670 BP30 выбросов фильтр для Alexa 647). Микрочипы будут отсканированы с нитроцеллюлозы стороной вниз на лоток стекло сканера.
- Сохранить флуоресцентные изображения в виде файлов TIFF и используя набор Photoshop изображение размером до 17 х 25 см и разрешением до 72 точек / см. Импорт изображений в DotScan программное обеспечение анализа для анализа интенсивности точек.
- DotReader захватывает цифровое изображение точки обязательным модель и количественная плотность клеточных обязательным для каждого антитела точка на 8 бит серости шкале (1-256 U). Иногда неспецифический изотипа контроль связывание вычитается из обязательного значения для антител с соответствующими изотипов иммуноглобулина. Dot интенсивности флуоресценции для каждого микрочипов были нормализованы против ярких точка установлена на уровне 100% интенсивности. Сигнал / место силы было зафиксировано в. XML-файл (исходные данные) или представлены в виде гистограммы в. PDF-файл (окончательный)
- Microarray heatsmaps и иерархической кластеризации были проведены с использованием MultiExperiment Viewer (МэВ) версии 4.4 от ТМ4 Microarray Software Suite ( http://www.tm4.org/mev.html ). Иерархическая кластеризация проводили на фоне скорректированных данных с использованием МэВ с полным анализом связей. Евклидово расстояние было использовано для меры сходства. 2-хвостами Стьюдента-тест с равной дисперсии был использован для определения статистической значимости результатов.
5. Представитель Результаты:
Результаты микрочипов DotScan должен показать последовательное ячейки обязательным моделей между дублировать массивы. Сильное выравнивание точку привязки (CD44/CD29) позволяет сетке находиться над массивом района. На рисунке 2 показан пример оптимального захвата клеток и мультиплексирование. На рисунке 3 приведены некоторые общие проблемы, возникшие в ходе захвата клеток и возможные решения.
Клетка микрочипов обязательные результаты могут быть количественно путем измерения интенсивности точка, высказанные по серости шкале от 1 до 256. На рисунке 4 показаны цифровые данные с 58 хирургических образцов КПР, окрашивали EpCam-Alexa 647 антитела, как Тепловая карта с иерархической кластеризации. Хотя количество образцов ограничено, контрольных сумм из той же стадии, как правило, кластер в одной группе.
Рисунок 2. Сотовый обязательной структуре клинических колоректального рака опухоли (Австралийский Клинико-патологические Подмости, ACP этапе B1). () DotScan антител ключевым изображением расположения антитела для левой половины дублировать микрочипов (очерчен). Верхняя часть содержит оригинальные 82 антитела микрочипов лейкемии DotScan. Еще 40 антител, соответствующие конкретным антигенам поверхности оказались до регулируемых в литературе, были добавлены в качестве микрочипов "спутник" КПР. Нижняя секция состоит из изотипа антител управления (б) Оптическое изображение клетки КПР привязки к микрочипов. (С) CD3 флуоресценции изображение, показывающее Т-клеток. (Г) EpCam флуоресценции изображение, показывающее CRC клеток.
Рисунок 3. Примеры плохого DotScan результаты и возможные решения. () Низкая ячейки обязательными; Решение: убедитесь, что по крайней мере 4x106 жизнеспособных клеток находятся в массиве (б) Изотип контроль обязательных и необязательных определенной ячейке обязательными; решение: добавить тепла инактивированной человеческой сыворотки АВ образца до инкубации на микрочипов, чтобы минимизировать изотипа контроля обязательными. Иногда небольшое количество неспецифического связывания клеток к нитроцеллюлозы происходит с КПР образцов и не оказывает существенного влияния на результаты. (С) Нитроцеллюлоза высыхания во время инкубации; решение: обеспечить выборка охватывает целый раздел нитроцеллюлозы и микрочипов, инкубируют на плоской поверхности. (Г) высокий артефактов фона; решение: обеспечитьмикрочипов тщательно промывают после инкубации.
Рисунок 4. DotScan программного обеспечения для анализа порожденных гистограммы представляющие ячейку обязательным плотностей на серость шкале от 1 до 256. Цифры на оси ссылаются на CD антигенов. Другие сокращения TCR, Т-клеточного рецептора; κ, λ, легких цепей иммуноглобулинов; SIG, поверхностных иммуноглобулинов; DCC, удаленные в колоректального рака белка, EGFR, рецептор эпидермального фактора роста, ФАП, белок фибробластов активации; HLA-A, B, С HLA-DR, антигены лейкоцитов человека и DR, B, C соответственно; ММВА, MHC класса I цепь связанных белков, MMP-14, матрица metallopeptidase 14; PIGR, полимерные рецепторов иммуноглобулинов; TSP-1, тромбоспондин-1; Мабтера, гуманизированные анти-CD20. Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом видео показано, как DotScan микрочипов антитела могут быть использованы в простых, полуколичественный способ изучения профилей поверхностного антигена для популяции клеток из ткани КПР.
Получение жизнеспособных суспензии отдельных клеток из ткани имеет решающее значение для успеха эксперимента, так как энергия-зависимые процессы (например, антиген укупорки и / или псевдоподии образования) представляется, необходимых для прочное связывание целых клеток в антитело точками во время инкубации, в то время как мертвые клетки затем смыть. Тип 1 коллагеназы изначально используемые для ткани disaggregation8, но был заменен коллагеназы 4, которые в меньшей степени вызывает повреждение клеточных мембран, так как она содержит меньше загрязнений протеазы. Это изменение не влияет на выход ячейки, жизнеспособности или обязательной узоры. Слизь из некоторых опухолях и контрольных образцов уменьшается выход ячейки и мешал ячейке захвата. Это клейкость слизи было свести к минимуму, хранение разбивкой суспензии клеток в 10% ДМСО / ФТС при -80 ° С, по-видимому из-за изменений в слизи свойства после замораживания и оттаивания 9. Впоследствии все образцы хранились замороженными в 10% ДМСО / ФТС после разукрупнения и были быстро талой производить жизнеспособные клеточные суспензии, с последовательным обязательным узоры. Образцы с <50% жизнеспособность или показ бедных обязательными для выравнивания / обслуживание точек (CD44/CD29) были исключены из анализа.
Несколько клонов антител показали снижение сродства при привязке к нитроцеллюлозы возможно, связано с изменением конформации, например, известный маркер CRC CD15s было очень мало или вообще не клетка обязательными. Антитела, которые выставлялись последовательно отрицательные результаты должны быть заменены другими гибридомных клонов. Другой возможной причиной плохого активность некоторых антител помехи связывания бычьего сывороточного альбумина (БСА). BSA без антител должен использоваться на микрочипов где это возможно.
Хотя большой когорты пациентов, необходимые для статистического анализа данных микрочипов, иерархической кластеризации наших результатов (58 клинических образцов) была обнадеживающей. Нормализация данных с использованием подходов, описанных Ян 10 должно обеспечить улучшенную статистической значимости.
Хотя DotScan микрочипов антител позволяет определить новые формы выражения известных антигенов CD, он наиболее эффективен при использовании в комбинации с протеомных методов открытия, такие как 2-мерные гель-электрофореза и LC-iTRAQ-MS, выявить новые дифференциально обильные белки . Такие белки романа потенциальных маркеров; соответствующие антитела могут быть добавлены в массив, и подтверждены клиническими образцами КПР.
Использование флуоресцентно-меченых антител к профилю подмножества захваченных клеток обеспечивает мощную платформу для DotScan анализ смешанных популяций клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим сотрудников Анатомические лаборатории патологии Королевский Принца Альфреда и Согласия Репатриация Больницы для сбора свежих образцов КПР и нормальной слизистой оболочки кишечника. Работа финансировалась института рака Нового Южного Уэльса Поступательное Программа грантов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington Biochemical | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo Medical Corp. | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 µm) | Filcon filter (50 µm) Filcon filter (50 µm) 340603 | |
| Fetal calf serum | GIBCO, by Life Technologies | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon Instruments | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner Bio-One | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalge Nunc international | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark Corporation | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phyc–rythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter Inc. | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
- Steinert, R., Buschmann, T., vander Linden, M., Fels, L. M., Lippert, H., Reymond, M. A. The role of proteomics in the diagnosis and outcome prediction in colorectal cancer. Technol. Cancer. Res. Treat. 1, 297 (2002).
- Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
- Swerdlow, S. H., Campo, E., Harris, H. L., Jaffe, E. S., Pileri, S. A., Stein, H., Thiele, J., Vardiman, J. W. WHO classification of tumour of haematopoietic and lymphoid tissues. IARC WHO Classification of Tumours. 2, Fourth, (2008).
- Xiao, G. G., Recker, R. R., Deng, H. W. Recent advances in proteomics and cancer biomarker discovery. Clin. Med. Oncol. , (2008).
- Belov, L., Mulligan, S. P., Barber, N., Woolfson, A., Scott, M., Stoner, K., Chrisp, J. S., Sewell, W. A., Bradstock, K. F., Bandall, L., Pascovici, D. S., Thomas, M., Erber, W., Huang, P., et al. Analysis of human leukaemias and lymphomas using extensive immunophenotypes from an antibody microarray. Br. J. Haematol. 135, 184 (2006).
- Belov, L., Huang, P., Barber, N., Mulligan, S. P., Christopherson, R. I. Identification of repertories of surface antigens on leukemias using an antibody microarray. Proteomics. 3, 2147 (2003).
- Zhou, J., Belov, L., Huang, P. Y., Shin, J., Solomon, M. J., Chapuis, P. H., Bokey, L., Chan, C., Clarke, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Surface antigen profiling of colorectal cancer using antibody microarrays with fluorescence multiplexing. J. Immunol. Methods. 355 (1-2), 40-51 (2010).
- Ellmark, P., Belov, L., Huang, P., Lee, C. S., Solomon, M. J., Morgan, D. K., Christopherson, R. I. Multiplex detection of surface molecules on colorectal cancers. Proteomics. 6, 1791 (2006).
- Pearson, J. P., Allen, A., Hutton, D. A.
- Yang, Y. H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D. M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T. P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation. Nucleic Acids Res. 30, 15 (2002).
- Al Saeed,, et al. TMA: A free, open-source system for microarray data management and analysis. BioTechniques. 34, 374-378 (2003).
Tags
Иммунологии выпуск 55 колоректальный рак лейкоциты антитела микрочипов мультиплексирование флуоресценция антигены CDErratum
Formal Correction: Erratum: Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing
Posted by JoVE Editors on 07/03/2015.
Citeable Link.
The author's email has been corrected in the publication of Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. There was an error with the author, Jerry Zhou's, email. The author's email has been updated to:
j.zhou@uws.edu.au
from:
jzho7551@mail.usyd.edu.au
