Summary

Câncer Colorretal Profiling proteína de superfície celular Usando um Microarray de anticorpos e Multiplexação de fluorescência

Published: September 25, 2011
doi:

Summary

Nós descrevemos um procedimento para a desagregação de câncer colorretal (CRC) para produzir células viáveis ​​única, que são, então, capturado em microarrays de anticorpos personalizado reconhecer antígenos de superfície (CRC DotScan microarray). Sub-populações de células vinculada ao microarray pode ser perfilado por multiplexação de fluorescência usando anticorpos monoclonais marcados com corantes fluorescentes.

Abstract

O prognóstico atual e classificação do CRC conta com encenação de sistemas que integram achados histopatológicos e clínicos. No entanto, na maioria dos casos CRC, disfunção das células é o resultado de numerosas mutações que modificam a expressão da proteína e pós-translacionais modificação 1.

Um número de antígenos de superfície celular, incluindo cluster de diferenciação (CD) de antígenos, foram identificados como prognósticos ou potenciais biomarcadores metastático em CRC. Estes antígenos fazer biomarcadores ideal como sua expressão muitas vezes muda com a progressão do tumor ou interações com outros tipos de células, como linfócitos tumor infiltrantes (TILs) e tumor associado macrófagos (TAMs).

O uso da imuno-histoquímica (IHQ) para o câncer de sub-classificação e prognóstico é bem estabelecida para alguns tipos de tumor 2,3. No entanto, não 'marcador' single mostrou significado prognóstico maior do que clínico-patológica de teste ou ganhou ampla aceitação para uso em relatórios de patologia de rotina de todos os casos CRC.

Uma abordagem mais recente para a estratificação prognóstica de fenótipos da doença depende de perfis de proteínas de superfície usando vários "marcadores". Enquanto perfil de expressão de tumores através de técnicas proteômicas como iTRAQ é uma poderosa ferramenta para a descoberta de biomarkers4, não é ideal para uso rotineiro nos laboratórios de diagnóstico e não pode distinguir diferentes tipos de células em uma população mista. Além disso, grandes quantidades de tecido tumoral são necessários para a caracterização de glicoproteínas da membrana plasmática purificada por estes métodos.

Neste vídeo nós descrevemos um método simples para criar perfis de superfície proteoma de células viáveis ​​a partir de amostras desagregadas CRC usando um anticorpo DotScan microarray CRC. O microarray 122-anticorpo consiste em uma região de anticorpos 82-standard reconhecendo uma série de marcadores de linhagem específica de leucócitos, moléculas de adesão, receptores e marcadores de inflamação e resposta imune 5, bem como uma região satélite para a detecção de 40 marcadores potencialmente prognóstico para CRC . Células são capturadas apenas em anticorpos para os quais eles expressam o antígeno correspondente. A densidade de células por ponto, determinado pelo escaneamento óptico, reflete a proporção de células que expressam esse antígeno, o nível de expressão do antígeno e afinidade do anticorpo 6.

CRC de tecido ou mucosa intestinal normal, scans óptica refletem o imunofenótipo de populações mistas de células. Multiplexação de fluorescência pode então ser usada para perfil selecionado sub-populações de células de interesse capturado no array. Por exemplo, Alexa molécula de adesão 647-anti-células epiteliais (EpCAM; CD326), é um antígeno de diferenciação pan-epiteliais que foi usado para detectar células CRC e também células epiteliais da mucosa intestinal normal, enquanto Ficoeritrina-anti-CD3, foi usado para detectar infiltração de células T-7. O CRC DotScan microarray deve ser o protótipo de uma alternativa de diagnóstico para o sistema de estadiamento baseado anatomicamente CRC.

Protocol

O fluxo de trabalho figura 1. Para a preparação de uma suspensão de células vivas a partir de uma amostra cirúrgica do CRC. 1. Desagregação amostra clínica Todas as amostras foram coletadas do Príncipe Real Alfred Hospital (Camperdown, NSW, Austrália) e Hospital Repatriação Concord (Concord West, NSW, Austrália) com o consentimento informado nos termos do Protocolo n…

Discussion

Neste vídeo, demonstramos como o microarray de anticorpos DotScan pode ser usado em uma forma simples e semi-quantitativa para estudar perfis de antígeno de superfície para as populações de células do tecido CRC.

Obtenção de uma suspensão de células viáveis ​​único a partir do tecido é fundamental para o sucesso do experimento, porque a energia dependente de processos (por exemplo, antígeno de nivelamento e / ou formação de pseudópodos) parecem ser necessárias para a li…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a equipe do Laboratório de Anatomia Patológica do Príncipe Real Alfred e Hospitais Repatriação Concord para a recolha de amostras frescas de CRC e na mucosa intestinal normal. O trabalho foi financiado por um New South Wales Instituto do Câncer Grant Programa translacional.

Materials

Name of reagent or equipment Company Catalogue number Comments
Hanks’ balanced salt solution Sigma-Aldrich H6136-10X1L Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375)
Airpure biological safety cabinet class II Westinghouse 1687-2340/612  
Surgical blades Livingstone 090609 Pack of 100
RPMI 1640 with 2 mM Hepes Sigma-Aldrich R4130-10X1L  
Collagenase type 4 Worthington 4188  
Deoxyribonuclease 1 Sigma-Aldrich DN25-1G  
Terumo Syringe (10 mL) Terumo SS+10L Box of 100
Filcon filter (200 μm) BD Biosciences 340615  
Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603  
Fetal calf serum Gibco/Invitrogen 10099-141  
Centrifuge 5810 R Eppendorf 7017  
Dimethyl sulphoxide Sigma-Aldrich D2650  
Trypan blue Sigma-Aldrich T8154  
Hemocymeter Technocolor Neubar Hirschmann not available  
Light microscope Nikon Nikon TMS  
Cyrovial tubes Greiner bio-one 121278  
Cryo freezing contrainer Nalgene 5100-0001  
DotScan antibody microarray kit Medsaic not available  
DotScan microarray wash tray Medsaic not available  
KimWipes Kimberly-Clark 4103  
Formaldehyde 37% Sigma-Aldrich F1635-500ML  
DotReaderTM Medsaic not available  
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418-10G  
Heat-inactivated AB serum 2% Invitrogen 34005100  
Phycoerythrin-conjugated CD3 Beckman Coulter ET386  
AlexaFluor647-conjugated EpCAM BioLegend 324212  
Typhoon FLA 9000 GE Healthcare 28-9558-08 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647
MultiExperiment Viewer v4.4 TM4 Microarray Software Suite Open – source software (Ref 11)  

References

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  2. Eifel, P., Axelson, J. A., Costa, J., Crowley, J., Curran, W. J., Deshler, A., Fulton, S., Hendricks, C. B., Kemeny, M., Kornblith, A. B., Louis, T. A., Markman, M., Mayer, R., Roter, D. National Institutes of Health Consensus Development Conference Statement: adjuvant therapy for breast cancer. J. Natl. Canc. Inst. 93, 979 (2001).
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Cite This Article
Zhou, J., Belov, L., Solomon, M. J., Chan, C., Clarke, S. J., Christopherson, R. I. Colorectal Cancer Cell Surface Protein Profiling Using an Antibody Microarray and Fluorescence Multiplexing. J. Vis. Exp. (55), e3322, doi:10.3791/3322 (2011).

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