و<em> في الموقع</em> بروتوكول التهجين الموصوفة هنا يسمح للتوطين المباشر مرنا والصغيرة تعبير الحمض النووي الريبي على المستوى الخلوي مع حساسية عالية وخصوصية. هو الأمثل لإجراء البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة النباتية ، ينطبق على طائفة واسعة من النباتات والأنسجة ، ويمكن أن تكتمل في غضون عشرة أيام.
مع التقدم في أبحاث الجينوم في العقد الماضي ، شهدت العديد من الدراسات بيولوجيا النبات على نطاق واسع تقديم التحليلات الكمية في التعبير الجيني. ويجري استخدام ميكروأري وتسلسل الجيل المقبل النهج للتحقيق في عمليات الاستجابة التنموية والفسيولوجية والإجهاد ، وتشريح اللاجينية والصغيرة مسارات الحمض النووي الريبي ، وبناء شبكات الجينات التنظيمية 1-3 الكبيرة. في حين أن هذه التقنيات تسهيل تحليل الجينات في وقت واحد من مجموعات كبيرة ، لأنها توفر عادة القرار محدود جدا من التغييرات spatiotemporal التعبير الجيني. ويمكن التغلب على هذا القيد جزئيا باستخدام أسلوب التنميط بالتزامن مع lasermicrodissection أو مضان تنشيط الخلايا فرز 4-7. ومع ذلك ، ولكي نفهم تماما الدور البيولوجي للجين ، ومعرفة نمط spatiotemporal التعبير في القرار الخلوية الأساسية. ولا سيما عند دراسة تطوير أو آثار بيئية STIيمكن المولى والمسوخ تحليل مفصل لنمط التعبير الجين أصبح أساسيا. على سبيل المثال ، يمكن أن الاختلافات الكمية خفية في مستويات التعبير عن الجينات التنظيمية الرئيسية تؤدي إلى الظواهر الدرامية عندما يرتبط مع الخسارة أو الربح التعبير في أنواع معينة من الخلايا.
وتستخدم عادة عدة طرق لفحص تفصيلي لأنماط التعبير الجيني. هو واحد من خلال تحليل خطوط مراسل المعدلة وراثيا. ويمكن هذا التحليل ، ومع ذلك ، أصبحت تستغرق وقتا طويلا عند تحليل جينات متعددة أو يعملون في مصانع لتحويل المتمردة. علاوة على ذلك ، عادة ما هو مطلوب التحقق المستقل للتأكد من أن نمط التعبير الذي يحاكي التحوير من الجينات المحلية. المناعى توطين البروتين أو مرنا في التهجين الموضع الحالي بدائل سريعة نسبيا لرؤية مباشرة في التعبير الجيني في الخلايا والأنسجة. هذا الأخير لديه ميزة واضحة أنه يمكن أن يكون بسهولة شالحوار الاقتصادي الاستراتيجي على أي من الجينات الفائدة. التهجين في الموقع تتيح الكشف عن mRNAs المستهدفة في الخلايا عن طريق التهجين مع الحمض النووي الريبي لمكافحة الشعور المسمى التحقيق التي حصلت عليها في المختبر النسخ من الجينات في المصالح.
نحن هنا الخطوط العريضة لبروتوكول للتوطين في الوضع الطبيعي في التعبير الجيني في النباتات التي هي حساسية عالية ومحددة. هو الأمثل للاستخدام مع بارافورمالدهيد الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ من المقاطع ، والتي تعطي حماية ممتازة من الأنسجة ، وتحقيقات DIG ذات العلامات التي تصور من قبل المناعية للكشف عن والفوسفاتيز القلوية رد الفعل اللونية. وقد تم بنجاح تطبيق هذا البروتوكول إلى عدد من الانسجة من طائفة واسعة من الأنواع النباتية ، ويمكن استخدامها لتحليل التعبير عن mRNAs فضلا الرناوات الصغيرة 8-14.
في أسلوب التهجين في الموضع المذكورة هنا يسمح للرؤية مباشرة للنمط التعبير الجيني spatiotemporal أي اهتمام لقرار الخلوية كبيرة وحساسية عالية وخصوصية. البروتوكول لا يسمح بالمقارنة الكمية للمستويات التعبير بين الجينات. ومع ذلك ، يمكن للحساسية العالية والأسلوب القرار تكشف التدرجات في التعبير الجيني داخل أنسجة 8 ، 18 ، وهو غير ممكن مع معظم وسائل أخرى للتحليل التعبير الجيني.
البروتوكول يتضمن العديد من الخطوات ، التي يمكن أن تجعل حل المشاكل مشاكل. أهم الخطوات للبروتوكول هي تثبيت للأنسجة واختيار ووضع العلامات على التحقيق. سوف الأنسجة تسلل سيئة وتحقيقات مع إدماج DIG منخفضة الغلة اشارات ضعيفة جدا التي قد يكون من الصعب الكشف عن الخلفية أعلاه. لكل جين جديد لسعر الفائدة ، فمن المستحسن لمحاولة تحقيقات قليلة متميزة مستمدة من diffeاستئجار مناطق نسخة. أحيانا ، قد اثنين أو ثلاثة تحقيقات تستهدف مختلف مناطق أصغر من الجينات يمكن الجمع بين الحاجة إلى الحصول على إشارة قوية التهجين ومحددة. بالإضافة إلى ذلك ، الشروط التهجين ، مثل درجة الحرارة وتكوين العازلة التهجين ، يمكن أن يكون الأمثل لكل جينة أو أنسجة لخفض أو زيادة التشدد التهجين. أيضا الخطوة العلاج البروتيني هو متغير ويمكن تغييرها لتكييف بروتوكول للأنواع النباتية المختلفة أو للكشف عن النصوص مع وفرة منخفضة جدا. سيتم إدراج كل من تحقيقات الرقابة الإيجابية والسلبية تكون مفيدة في تحديد نقاط إشكالية البروتوكول.
هو الأمثل لإجراء البارافين جزءا لا يتجزأ من أقسام الأنسجة النباتية ولكن يمكن استخدامها مع تعديلات طفيفة أيضا في جبل لكامل الموقع التهجين. وعلى الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في البحوث الحيوانية 19 ، جبل بأكمله في الموقع التهجين يكون لimited إلى الأنسجة النباتية التي يمكن أن تكون مخترقة بسهولة ، مثل الأجنة ، والجذور أو الأنسجة meristematic الشباب 20،21. ويمكن أيضا أن يتم تعديل البروتوكول بسهولة اكتشاف وقت واحد اثنين mRNAs مميزة أو توطين النصوص جنبا إلى جنب مع بروتينات 15،22،23. أخيرا ، فمن الممكن لتوسيع نطاق تطبيق هذا الأسلوب على تصور أنماط التعبير RNA الصغيرة في النباتات. وقد تم تحديد أنماط التعبير ميرنا باستخدام هذا البروتوكول في كل من الذرة وArabidopsis 8،14. في الآونة الأخيرة ، تم استبدال تحقيقات في كتب من قبل المختبر المتاحة تجاريا DIG المسمى الحمض النووي مؤمن (LNA) والتي تزيد بنسبة ضئيلة تحقيقات حساسية إشارة 18 ، 24.
The authors have nothing to disclose.
ويدعم البحوث في مختبر طن متري من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم الوطنية (DBI – 0820610 و 1022102 IOS) ونيويورك وزارة الصحة (NYSTEM – C024308). تلقى CM زمالات ما بعد الدكتوراه من وزارة التربية والتعليم الإسبانية والعلوم (2007-0937) ورافائيل ديل بينو مؤسسة واسبانيا.
Product | Company | Catalogue number | Remarks |
---|---|---|---|
Cytoseal 60 4oz | Fisher | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
Histoclear | Fisher | 50-899-90147 | |
Tissue Path Paraplast Plus | Fisher | 23-021-400 | |
N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega | M6101 | |
DIG-labeled Control RNA | Roche | 11585746910 | |
DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 10810274001 | |
T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 11031163001 | |
T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 10881767001 | |
RNase-A | Roche | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
Blocking Reagent | Roche | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche | 1 093 274 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 1 681 451 | |
mini Quick Spin RNA Columns | Roche | 11814427001 | |
tRNA from E. coli | Roche | 109541 | |
Triton®X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
Triethanolamine | Sigma | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
Acetic anhydride | Sigma | A6404 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma | D2532 | |
Albumin from bovine serum – ≥98% | Sigma | A7906 | |
Eosin Y disodium salt | Sigma | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Ethanol absolute 200 proof | |||
Phenol/chloroform | |||
Base moulds | Electronic Microsocpy Science | 62352-15 | |
Embedding rings | Fisher | 22-038-197 | |
20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR | 66020-326 | |
Probe-on-plus slides | Fisher | 22-230-900 | |
Micro cover glasses 24×50 mm | VWR | 48404-452 | |
Whatman paper 3mm | VWR | 89022-360 | |
Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electronic Microsocpy Science | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
18 clean plastic containers | Electronic Microsocpy Science | 71402 | |
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
Microtome | Leica | ||
Self-cleaning dry vacuum system | Welch | 2025 | |
Slide warmer | Fisher | ||
Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
Incubator at 58-60°C | Fisher | For steps with molten Paraplast | |
Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher | Need two due to the quick change between temperatures | |
Centrifuge (4°C – 20°C) | |||
Fume hood |