“<em>原位</em>这里描述的杂交协议允许的mRNA和小RNA在细胞水平的高灵敏度和特异性表达的直接本地化。石蜡包埋植物组织切片进行了优化的过程,是适用于广泛的植物和组织,并可以在十天内完成。
随着基因组学研究在过去十年的进步,植物生物学已经看到大量的研究,提出大型基因表达的定量分析。正在使用的芯片和下一代测序方法调查发育,生理应激反应过程,解剖后生和小RNA的途径,并建立大的基因调控网络1-3。虽然这些技术方便的大型基因组的同时分析,他们通常会提供一个非常有限的时空分辨率,基因表达的变化。这种限制可以通过使用分析方法结合lasermicrodissection或荧光激活细胞分选4-7部分克服。然而,要充分认识的一个基因的生物作用,在细胞决议,其表达的时空格局知识是必不可少的。特别是,当研究发展或环境STI影响木里和突变体的一个基因的表达模式的详细分析变得至关重要。例如,在微妙的关键调控基因的表达水平的定量差异可能导致在特定的细胞类型中表达的损失或收益时,戏剧性的表型。
有几种方法经常用于基因表达模式的详细检查。其一是通过转基因记者线的分析。 ,但是,这种分析可以成为耗时分析多个基因或植物顽抗转型工作。此外,一个独立的验证,以确保转基因表达模式模拟的内源性基因,通常是必需的。免疫组化蛋白定位或mRNA原位杂交中,目前基因表达的细胞和组织内的直接可视化的比较快的替代品。后者具有明显的优势,它可以很容易ü任何感兴趣的基因原位杂交。SED允许一个标记的反义RNA杂交细胞与靶mRNA的检测探头在体外感兴趣的基因的转录获得。
在这里,我们为协议大纲在原位定位基因在植物中的表达,是高度的敏感性和具体。它是使用多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,这给组织学的优秀保存,地高辛标记探针免疫检测和碱性磷酸酶比色法反应的可视化进行了优化。该协议已成功地应用于广泛的植物物种组织,可用于分析mRNA的以及小分子RNA 8-14表达。
这里列出的原位杂交方法允许任何感兴趣的基因的时空表达模式的直接可视化的伟大细胞高分辨率,高灵敏度和特异性。该协议不允许之间的基因表达水平的定量比较。然而,该方法的高灵敏度和分辨率,可以揭示一个组织8,18,这是不与其他方法分析基因表达的最可能的基因表达梯度。
该协议包括许多步骤,它可以使故障排除问题。该协议的最重要的步骤是固定的组织和探头的选择和标签。低渗透组织和辛掺入低探头将产生非常微弱的信号,可能很难检测到上述背景。为每个感兴趣的新基因,它是明智的尝试从diffe派生的几个不同的探头租金地区的成绩单。有时候,可能需要两个或三个探测器,针对不同的小区域的基因结合,以获得一个强大的和特定的杂交信号。此外,杂交条件,如温度和杂交缓冲液组成,,可以优化每个基因或组织,以降低或增加杂交紧缩。蛋白酶处理步骤是一个变量,可以改变,以适应不同植物物种或成绩单非常低丰度的检测协议。列入正反两方面的控制探头将有助于查明问题的协议。
石蜡包埋植物组织切片,但稍作修改, 可以在原位杂交用于整个安装过程优化。虽然广泛用于原位杂交动物研究19日 ,整装将升imited到植物组织中,可以很容易地渗透,如胚胎,根或年轻的分生组织20,21。该协议还可以很容易地修改,同时检测两种截然不同的mRNA或本地化一起蛋白 15,22,23的成绩单。最后,它有可能延长这种方法的应用,小分子RNA在植物中的表达模式的可视化。 miRNA表达模式已经确定使用在玉米和拟南芥8,14本议定书。最近, 在体外转录探头已经取代市售高辛标记的锁核酸(LNA),寡核苷酸探针,提高信号灵敏度18,24。
The authors have nothing to disclose.
在实验室吨的研究是由国家科学基金会(DBI – 0820610和IOS – 1022102)和纽约州卫生署(NYSTEM C024308)的赠款支持。 CM收到来自西班牙教育和科学部(2007-0937)和基金会拉斐尔 – 皮诺,西班牙部博士后。
Product | Company | Catalogue number | Remarks |
---|---|---|---|
Cytoseal 60 4oz | Fisher | 23-244-256 | Toluene-based 8310-4 |
Histoclear | Fisher | 50-899-90147 | |
Tissue Path Paraplast Plus | Fisher | 23-021-400 | |
N+ nylon membrane Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN203B | |
RNase OUT; 40 U/μL | Invitrogen | 10777019 | |
RQ1 RNase-Free DNase; 1 U/μl | Promega | M6101 | |
DIG-labeled Control RNA | Roche | 11585746910 | |
DIG RNA labeling mix | Roche | 11277073910 | |
SP6 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 10810274001 | |
T3 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 11031163001 | |
T7 RNA polymerase 1,000 U | Roche | 10881767001 | |
RNase-A | Roche | 109142 | dissolve in glycerol 50% Tris 100mM pH8.0 |
Blocking Reagent | Roche | 1 096 176 | Heat up to 70°C in TBS buffer |
Anti-Digoxygenin-AP, Fab fragments from sheep 150 U | Roche | 1 093 274 | |
NBT/BCIP stock solution | Roche | 1 681 451 | |
mini Quick Spin RNA Columns | Roche | 11814427001 | |
tRNA from E. coli | Roche | 109541 | |
Triton®X-100 | Sigma | T8787 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | |
Protease from Streptomyces griseus Type XIV | Sigma | P5147 | Dilute in milliQ water and pre-digest 4 hours at 37°C |
Triethanolamine | Sigma | 90279 | Dilute in water, bring to pH8.0 with HCl |
Acetic anhydride | Sigma | A6404 | |
Dextran sulfate sodium salt from Leuconostoc spp. | Sigma | D8906-5G | Dextran Sulfate should be heated to 80°C to dissolve. |
Denhardt’s Solution 50x Concentrate | Sigma | D2532 | |
Albumin from bovine serum – ≥98% | Sigma | A7906 | |
Eosin Y disodium salt | Sigma | E4382 | Dissolve in 96-100% ethanol until saturated |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Ethanol absolute 200 proof | |||
Phenol/chloroform | |||
Base moulds | Electronic Microsocpy Science | 62352-15 | |
Embedding rings | Fisher | 22-038-197 | |
20ml disposable scintillation vials, with caps | VWR | 66020-326 | |
Probe-on-plus slides | Fisher | 22-230-900 | |
Micro cover glasses 24×50 mm | VWR | 48404-452 | |
Whatman paper 3mm | VWR | 89022-360 | |
Three glass dishes and one stainless steel slide rack | Electronic Microsocpy Science | 71420-25 | Two glass dished are necessary for histoclear treatment and the last one is used for the acetic anhydride treatment |
18 clean plastic containers | Electronic Microsocpy Science | 71402 | |
2 or 3 large flat plastic boxes with sealable lids | required for the hybridization and antibody steps | ||
Fine brushes | Help handing wax ribbons | ||
Microtome | Leica | ||
Self-cleaning dry vacuum system | Welch | 2025 | |
Slide warmer | Fisher | ||
Heating block | needed at 60°C and 85°C | ||
Incubator at 58-60°C | Fisher | For steps with molten Paraplast | |
Ovens or water baths for 55°C and 37°C | Fisher | Need two due to the quick change between temperatures | |
Centrifuge (4°C – 20°C) | |||
Fume hood |