Enkelt Les og Sammenkoblede Slutt mRNA-Seq Illumina Bibliotekene fra 10 nanogram Total RNA

Summary

Her beskriver vi en metode for utarbeidelse av både single lese og koblet end Illumina mRNA-Seq sekvensering biblioteker for genekspresjonsanalyse basert på T7 lineære RNA forsterkning. Denne protokollen krever bare 10 nanogram av å starte total RNA og genererer svært konsistente bibliotekene representerer hele transkripsjoner.

Abstract

Whole transkriptom sekvensering av mRNA-Seq brukes nå i stor utstrekning til å utføre global genekspresjon, mutasjon, allel-spesifikke uttrykk og andre genom-wide analyser. mRNA-Seq åpner selv porten for genekspresjonsanalyse av ikke-sekvensert genomene. mRNA-Seq gir høy følsomhet, et stort dynamisk område og muliggjør måling av vitnemål kopiere numre i en prøve. Illumina genom analysator utfører sekvensering av et stort antall (> 10 ⁷⁾ av relativt kort sekvens leser (<150 bp). Den "paret end" tilnærming, hvor en enkelt lang lest er sekvensert i begge endene, gir mulighet for sporing alternative spleise veikryss , innsettinger og slettinger, og er nyttig for de novo transkriptom montering.

En av de store utfordringene forskerne er en begrenset mengde av utgangsmaterialet. For eksempel i eksperimenter der cellene er høstet av laser mikro-disseksjon, tilgjengelig fra total RNA may tiltaket i nanogram. Utarbeidelse av mRNA-Seq biblioteker fra slike prøver har blitt beskrevet ^{1, 2,} men innebærer betydelige PCR forsterkning som kan introdusere bias. Andre RNA-Seq bibliotek konstruksjon prosedyrer med minimal PCR forsterkning har blitt publisert ^{3, 4} men krever mikrogram mengder start total RNA.

Her beskriver vi en protokoll for Illumina Genome Analyzer II plattform for mRNA-Seq sekvensering for bibliotek forberedelse som unngår betydelige PCR forsterkning og krever bare 10 nanogram av total RNA. Mens denne protokollen har blitt beskrevet tidligere, og validert for single-end ⁵ sekvensering, der den ble vist å produsere retningsbestemt biblioteker uten å innføre betydelig forsterkning bias, her vi validere den videre til bruk som en sammenkoblet end protokoll. Vi selektivt forsterke polyadenylated messenger RNA fra start total RNA bruker T7 basert Eberwine lineær forsterkning metode, laget "T7LA "(T7 lineær forsterkning). Den forsterkede poly-A mRNAs er fragmentert, revers transkribert og adapter ligated å gi det endelige sekvensering biblioteket. For både single lese og koblet slutt kjører, sekvenser tilordnet den menneskelige transkriptom ⁶ og normalisert slik at data fra flere løper kan sammenlignes. Vi rapporterer de genuttrykk måling i enheter på utskrifter per million (TPM), som er et overordnet mål å RPKM når man sammenligner prøvene ^7.

Protocol

1. Isoler total RNA

1. Legg 1 ml Trizol til celler / vev, og homogenisere med 18-22 gasbind nål om nødvendig.
2. Tilsett 200 mL kloroform, og snurr på 14000 rpm i 30 minutter ved 4 ° C.
3. Ta ut topp vandig lag, tilsett 0,5 mL lineær akrylamid, og deretter legge 500 mL isopropanol. La sitte i romtemperatur i 20 minutter.
4. Spin på 14000 rpm ved 4 ° C, vask pellet med 70% etanol, og vakuum tørr.
5. Resuspender i 1 mL nukleasefritt fritt vann og overfør til 200 mL PCR tube.

2. Forbered dobbel strandet cDNA

1. Til ovennevnte 1 mL RNA tilsett 1 mL av 100 mM oligo-dT-T7 revers transkripsjon primer (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), varme ved 70 ° C (varme blokk) i 5 min, og snap avkjøles på is.
2. Tilsett 1 mL 5x FS buffer, 0,5 mL DTT, 0,5 mL dNTP mix og 0,5 mL RnaseOUT (fra hevet II kit).
3. Heat til 42° C i PCR maskin i 1 minutt, tilsett 0,5 mL Hevet II revers transkriptase. Inkuber i 1 time ved 42 ° C.
4. Heat ved 70 ° C i 10 minutter, avkjøles til 4 ° C.
5. På is, legg til følgende til ovennevnte reaksjonen:

• Nukleasefritt fritt vann - 22,75 mL
• 5X Second strand buffer - 7,5 mL
• dNTP mix - 0,75 mL
• E. coli DNA ligase - 0,25 mL
• E. coli DNA polymerase - 1 mL
• RnaseH - 0,25 mL

Inkuber for 2 timer ved 16 ° C og legg en mL T4 DNA Polymerase, og inkuber for ytterligere 10 minutter ved 16 ° C.

6. Overfør til 1,5 ml Eppendorf-rør, og legge 80 mL vann.
7. Tilsett 0,5 mL av lineære akrylamid.
8. Legg til 72 mL 3 M NH4OAc og 480 mL med kaldt 100% etanol. Bunnfallet for 1 time ved -20 ° C.
9. Spin på 14000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter, vask med 1 ml 70% etanol, sentrifuger ved 14 000 rpm for 2minutter, og vakuum tørke i ca 10 minutter.

3. Forsterke poly-A mRNA ved in vitro transkripsjon

1. Resuspender over cDNA i 3,5 mL nukleasefritt fritt vann.
2. Til ovennevnte, tilsett 1 mL hver av dNTPs (totalt 4 mL), 1 mL av 10X reaksjon buffer og 1 mL av T7 polymerase, og 0,5 mL av RnaseOUT fra Megascript kit.
3. Inkuber ved 37 ° C i PCR maskin over natten.
4. Klar for neste trinn. Kan oppbevares ved -80 ° C.

Fire. Fragmentering av forsterket poly-A mRNA

1. Legg til 26 mL vann til over reaksjonen og 4 mL 10x fragmentering reagens.
2. Heat i PCR maskin ved 70 ° C for nøyaktig 7 minutter.
3. Tilsett 5 mL av fragmentering stoppe buffer, sette prøve på is.

5. RNA rydde opp

1. Til ovennevnte reaksjonen, tilsett 60 mL vann og 350 mL buffer RLT fra Rneasy MinElute kit, og bland ved pipettering.
2. Tilsett 250 mL etanol, bland ved pipettering, og pipette i spinn kolonnen.
3. Spin i 8000 RCF i 20 sekunder.
4. Vask straks med RPE, spinne i 20 sekunder, vask andre gang med 80% EtOH, spin i 2 minutter, og tørk kolonne med 5 minutters spinn.
5. Eluer RNA i 10 mL nukleasefritt fritt vann.

Seks. cDNA syntese

Først strand syntese for enkelt lest biblioteket:

1. I en PCR rør, legge til følgende:

• Fragmentert Poly-A mRNA - 10 mL
• Noti Tilfeldige nonamer Primer - 1 mL

Inkuber ved 70 ° C i 5 minutter i thermocycler, og rask slappe av på is. Noti Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3). 5 'proksimale sekvens er Noti restriksjonen området mens den neste sekvensen inntil tilfeldig regionen er det motsatte utfylle av Illumina er adapter B sekvens fra Chip-Seq kit.

Til ovennevnte, legge til følgende på is (fra hevet III kit):

• 5X første tråd buffer -4 mL
• DTT - 2 mL
• dNTP blanding ^* - 1,5 mL

Sett på thermocycler i 2 minutter ved 42 ° C, tilsett 1 mL av hevet III revers transkriptase, og Inkuber ved 42 ° C i 1 time.

* I stedet for dCTP, var 5-metyl dCTP brukt i dNTP blandingen.

Først strand syntese for parede end biblioteket:

1. I en PCR rør, legge til følgende:

• Fragmentert Poly-A mRNA - 10 mL
• Tilfeldige hexamer primer - 1 mL

Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter i thermocycler, og rask slappe av på is.

2. Til ovennevnte, legge til følgende på is (fra hevet firststrand III kit):

• 5X første strand buffer - 4 mL
• DTT - 2 mL
• dNTPs (frakit) - 1,5 mL

Sett på thermocycler for 1 min ved 45 ° C, tilsett 1 mL av hevet III revers transkriptase, og Inkuber ved 45 ° C i 1 time.

Second strand syntese (for begge bibliotekene):

3. Til ovennevnte, legge til følgende på is (fra hevet II kit):

• Vann (RNase gratis) - 91 mL
• 5X Second Strand Buffer - 30 mL
• dNTPs (fra kit) - 3 mL
• E. coli DNA ligase - 1 mL
• E. coli DNA polymerase - 4 mL
• E. coli RNase H - 1 mL

Bland tube med inversjon, gi en kort sentrifugering og Inkuber ved 16 ° C i 2 timer.

7. Rense cDNA

1. Renser cDNA prøven med Zymo kolonner, Eluer i 40 mL vann for enkelt lese og 30 mL av vann for parede end bibliotek.

8. Slutt reparasjon

For enkelt lese biblioteket:

1. Til over 40 mL av cDNA, legg:

• T4 DNA ligase buffer med 10mm ATP - 5 mL
• dNTP mix - 2 mL
• T4 DNA polymerase - 1 mL
• Klenow enzym (fortynnet 1:05 med vann til 1U / mikroliter) - 1 mL
• T4 PNK - 1 mL

Inkuber i termisk cycler i 30 minutter ved 20 ° C.

For paret end biblioteket:

(Bruk Illumina paret slutten sample prep kit)

1. Til over 30 mL cDNA, legg:

• RNase DNase fritt vann - 45 mL
• T4 DNA ligase buffer med 10mm ATP - 10 mL
• 10mm dNTP mix - 4 mL
• T4 DNA polymerase - 5 mL
• Klenow enzym - 1 mL
• T4 PNK - 5 mL

Inkuber i termisk cycler i 30 minutter ved 20 ° C.

9. cDNA rydde opp

1. C lean opp cDNA bruker Zymo kolonner. Eluer i 34 mL av EB for enkelt lese og 32 mL av EB for parede end bibliotek.

10. Legg til 'A' baser til 3 'enden av DNA-fragmenter

For enkelt lese biblioteket:

1. Forbered følgende reaksjon mix:

• DNA-prøve - 34 mL
• Klenow buffer - 5 mL
• dATP - 10 mL
• Klenow exo - 1 mL

Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.

For paret end biblioteket:

1. Forbered følgende reaksjon mix:

• DNA-prøve - 32 mL
• Klenow buffer - 5 mL
• dATP - 10 mL
• Klenow exo - 3 mL

Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C.

11. cDNA rydde opp

1. Rydd opp cDNA bruker zymo kolonner. Eluer i 10 mL av EB.

12. Adapter ligation

jove_step "> For enkelt lese biblioteket:

(Bruk Illumina Chip-Seq sample prep kit)

1. Forbered følgende reaksjon mix:

• DNA-prøve - 10 mL
• Adapter Oligo Mix - 1 mL
• 2X DNA ligase buffer--15 mL
• DNA ligase - 4 mL

Inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. Adaptere bør tines på is og fortynnes 1:20.

For paret end biblioteket:

(Bruk Illumina paret slutten sample prep kit)

1. Forbered følgende reaksjon mix:

• DNA-prøve - 10 mL
• PE Adapter Oligo Mix - 10 mL
• 2X DNA ligase buffer - 25 mL
• DNA ligase - 5 mL

Inkuber i 15 minutter ved 20 ° C. Adaptere bør tines på is og fortynnes 1:20.

13. Ligation reaksjon rydde opp

1. Rydde opp i ligation reaksjonen bruker zymo kolonner. Eluer i 44 mL vann for enkelt lese bibliotek og 6 mL av EB etterfulgt av en annen eluering i 5 mL av EB for parede end bibliotek.

Utfør en Noti fordøyelsen, bare for én lest bibliotek

• cDNA - 44 mL
• NEB buffer 3-5 mL
• BSA - 0,5 mL
• Noti - 1 mL

Inkuber for 2 timer til over natten ved 37 ° C, og rense reaksjon bruke zymo kolonne. Eluer med 6 mL buffer EB etterfulgt av en andre eluering med 5 mL av EB.

14. Størrelse valg / Gel rensing

Utføre følgende ved hjelp av en 2% Sybr Trygg E-Gel fra Invitrogen.

1. Run Program 0-PreRun 2 minutter.
2. Load 1KB pluss stige fra Invitrogen fortynnet 1:4, og legge i 10 mL.
3. Last alle av DNA-prøve, og fylle tomme gater med 10 mL vann.
4. Run Program 1-EGel 2% Løp 28 minutter.
5. Størrelse velge 200-300 bp gel slice med en frisk barberblad.

15. Eluer DNA fra gel slice

1. Vei gel slice, og tilsett 3 bind av buffer QG til 1 volum av gel (bruk Gel Extraction kit fra Qiagen)
2. Inkuber ved 50 ° C i 10 minutter eller til gel slice oppløst.
3. Tilsett 1 volum av ispropanol, og bland ved inversjon eller pipettering.
4. Legg til i kolonnen, spinne i 1 minutt ved maksimal hastighet, og kast gjennomstrømning.
5. Legg til 500 mL buffer QG til kolonne, spinne i 1 minutt ved maksimal hastighet, og kast strømme gjennom.
6. Legg til 750 mL buffer PE til kolonne, spinne i 1 minutt ved maksimal hastighet, og kast strømme gjennom.
7. Sentrifuger i 1 minutt ved maksimal hastighet.
8. Eluer i 36 mL av EB for enkelt lese og 23 mL EB for parede end bibliotek.

16. PCR

For enkelt lese biblioteket:

(Bruk Illumina Chip-Seq sample prep kit)

1. Klargjør following PCR reaksjon mix:

• DNA - 36 mL
• 5X Phusion buffer - 10 mL
• dNTP mix - 1,5 mL
• PCR primer 1,1 til 1 mL
• PCR primer 2,1 til 1 mL
• Phusion polymerase - 0,5 mL

Bruk følgende PCR protokollen:

• 30 sekunder ved 98 ° C
• 10 sykluser av:
  • 10 sekunder ved 98 ° C
  • 30 sekunder ved 65 ° C
  • 30 sekunder ved 72 ° C
• 5 minutter ved 72 ° C
• Hold ved 4 ° C

^* Den første gangen at settet er brukt, fortynnes PCR primere 01:02 med EB buffer.

For paret end biblioteket:

(Bruk Illumina paret slutten sample prep kit)

1. Forbered følgende PCR reaksjon:

• DNA - 23 mL
• Phusion DNA polymerase - 25 mL
• PCR primer PE 1,1 til 1 mL
• PCR primer PE 2.1 -1 mL

Forsterke med følgende PCR protokollen:

1. 30 sekunder ved 98 ° C
2. 10 sykluser av:
   • 10 sekunder ved 98 ° C
   • 30 sekunder ved 65 ° C
   • 30 sekunder ved 72 ° C
3. 5 minutter ved 72 ° C
4. Hold ved 4 ° C

^* Den første gangen at settet er brukt, fortynnes PCR primere 01:02 med EB buffer.

17. Library rydde opp

1. Rydd opp i biblioteket ved hjelp zymo kolonner. Eluer i 12 mL av EB

18 år. Quantitate bibliotek

1. Quantitate biblioteket ved hjelp qubit. Den er klar for sekvensering. Bruk sekvensering primere fra Illumina enkelt lese cluster generasjon kit V4 eller høyere for enkelt lese bibliotek og Illumina sammen end cluster generasjon kit V4 eller høyere for parede end bibliotek.

19. Dataanalyse

Bowtie ⁶ ble brukt til map leser til RefSeq genet sett (NCBI Build 36.1). Singelen end leser (30 nukleotider) og paret slutt leser (42 nukleotider) ble kartlagt tillater opp til 10 kamper for å genet sett, og la opp til to uoverensstemmelser per lese. Avskrifter Per Million (TPM) verdier ble innhentet for å måle genuttrykk bruker RSEM ⁷ (RNA-Seq av Expectation-Maksimering).

20. Representant Resultater: Vi har laget T7LA biblioteker for både single lese og koblet slutt løper fra 1 mikrogram, 100 mikrogram, 10 mikrogram, 1 mg og 100 pg start total RNA (figur 1). For evaluering av protokoll vår, gjorde vi enkelt lese og koblet slutten biblioteker uten T7 RNA forsterkning med start fra 10 mikrogram total RNA Disse kontroll bibliotekene, kalt "MinAmp", har minimal forsterkning. Den eneste forsterkningen de gjennomgår er de 10 sykluser av PCR nær slutten av protokollen til ligate den Illumina sekvensering adaptere, et skritt som er felles for alle bibliotek. Alle RNA som ble brukt var isolert fra H14humane embryonale stamceller ^8.

Vi først evaluert antall gener identifisert av de ulike bibliotekene (Tabell 1 og supplerende Tabell 1). For både enkelt lese og koblet end biblioteker, identifisert 10 ng T7LA bibliotekene omtrent like mange gener som de 10 mikrogram MinAmp biblioteker, med en TPM på 10 eller mer. I tilfelle av singelen leste bibliotekene, identifisert 10 ng T7LA bibliotek 100% av 8500 gener identifisert av de 10 mikrogram unamplified bibliotek. For paret end biblioteker, identifisert 10 ng T7LA bibliotek 86% av gener identifisert av de 10 mikrogram unamplified bibliotek (7961 av 9267 gener). Biblioteker laget fra mindre enn 10 ng var ikke i stand til å identifisere så mange gener. For eksempel i singel lese protokollen, identifiserte en ng bibliotek bare ~ 50% av genene identifisert av de 10 mikrogram MinAmp bibliotek, tilskynder oss til å begrense det laveste beløpet av total RNA for bruk med T7LA protokollen til 10 ng. Videre kartlegging av housekeeping gen, GAPDH (figur 2) viser at alle T7LA biblioteker laget med minst 10ng å starte RNA identifisert alle eksoner, inkludert ekstreme 5 'ekson. Sammenligning av de 10 ng T7LA enkelt lese og koblet ende biblioteker med MinAmp bibliotekene viser en høy grad av likhet (Spearman korrelasjon, R = 0,90 og 0,95 henholdsvis figur 3a og b). Vi har også sammenlignet de to enkle lese og koblet slutten biblioteker laget fra 10 ng total RNA og de hadde en svært høy korrelasjon koeffisient (R = 0,92), viser at begge typer biblioteker gjort ved hjelp av T7LA protokoll produsere en svært lik genekspresjon underskrift ( Figur 3c.). Derfor er T7LA metoden i stand til å produsere sekvensering bibliotekene som er så pålitelig og omfattende som MinAmp bibliotekene, men fra 1000-fold mindre utgangsmaterialet.

Figur 1 skjema over sammenkoblede enden og enkelt lese bibliotek forberedelse protokollen.

jove_content ">
Figur 2 A genome nettleser bilde av en housekeeping gen, GAPDH, for alle single lest og koblet end biblioteker. Skalaen feltet til venstre for den enkle lese bibliotekene indikerer 350 total leser. Skalaen bar i sentrum for den sammenkoblede slutten bibliotekene indikerer 5000 total leser. Den horisontale aksen representerer genom sekvens av GAPDH.

Figur 3. Korrelasjon av gen uttrykk mellom de ulike bibliotekene (Spearmans):. A. Mellom enkelt lese 10 ng T7LA og 10 mikrogram MinAmp bibliotek viser at begge disse bibliotekene har en svært lik genuttrykk mønster (R = 0,90) B. mellom sammenkoblede slutten 10 ng T7LA og 10 mikrogram MinAmp bibliotek demonstrerer sin likheten av genuttrykk profiler (R = 0,95). C. Korrelasjon av genet expressions mellom 10 ng sammen enden og 10 ng enkelt lese bibliotekene viser en høy grad av likhet mellom disse bibliotekene utarbeidet av T7LA metode (R = 0,92).

Figur 4 Identifisering av humane embryonale stamceller spesifikke genes5 fra alle de enkelt lese og koblet end biblioteker.

Bibliotek	Type °	Raw Clusters	% Clusters passerer filter	% Justere til genomet	% Error Rate	Gener identifisert
MinAmp 10ug	Enkelt lest	225 602 + / - 4952	65,48 + / - 2.58	47,61 + / - 0.53	0,62 + / - 0.06	8500
1ug T7LA	Enkelt lest	144 818 + / - 6513	82,21 + / - 6.45	48,09 + / - 0.27	0,42 + / - 0,03	8757
100ng T7LA	Enkelt lest	27 385 + / - 1818	81,33 + / - 11.75	44,46 + / - 4.53	0,49 + / - 0.10	8709
10ng T7LA	Enkelt lest	11 184 + / - 985	60,70 + / - 3.70	14,96 + / - 1.15	0,99 + / - 0.30	8589
1ng T7LA	Enkelt lest	12 695 + / - 1365	53,27 + / - 16.76	4,08 + / - 0.79	2,25 + / - 1.56	4720
100pg T7LA	Enkelt lest	10 390 + / - 1398	72,99 + / - 2.90	1,48 + / - 0.20	1,51 + / - 0.39	1121
MinAmp 10ug	Sammenkoblede Slutt R1	95 786 + / - 12 937	90,77 + / - 2.79	58,50 + / - 0.95	0,94 + / - 0.38	9267
	Sammenkoblede Slutt R2	95 786 + / - 12 937	90,77 + / - 2.79	58,13 + / - 1.13	0,99 + / - 0.37
1ug T7LA	Sammenkoblede Slutt R1	297 669 + / - 10 196	91,35 + / - 0.36	46,89 + / - 0.14	0,47 + / - 0,01	7334
	Sammenkoblede Slutt R2	297 669 + / - 10 196	91,35 + / - 0.36	45,52 + / - 0.12	0,51 + / - 0,01
100ng T7LA	Sammenkoblede Slutt R1	205 602 + / - 9932	90,53 + / - 0.76	63,44 + / - 1,00	0,48 + / - 0.02	8011
	Sammenkoblede Slutt R2	205 602 + / - 9932	90,53 + / - 0.76	61,80 + / - 8.09	0,60+ / - 0.36
10ng T7LA	Sammenkoblede Slutt R1	214 622 + / - 11 155	89,98 + / - 1.13	56,32 + / - 1.94	0,80 + / - 0.26	7961
	Sammenkoblede Slutt R2	214 622 + / - 11 155	89,98 + / - 1.13	46,41 + / - 18.39	2,48 + / - 2.68	;
1ng T7LA	Sammenkoblede Slutt R1	144 951 + / - 19 841	90,54 + / - 1.19	3,91 + / - 0.16	8,71 + / - 0.86	8124
	Sammenkoblede Slutt R2	144 951 + / - 19 841	90,54 + / - 1.19	3,27 + / - 1.21	9,11 + / - 3.52
100pg T7LA	Sammenkoblede Slutt R1	187 600 + / - 11 759	89,52 + / - 1.11	1,78 + / - 0,05	13,42 + / - 0,50	6623
Sammenkoblede Slutt R2	187 600 + / - 11 759	89,52 + / - 1.11	1,99 + / - 0.23	15,29 + / - 0.96

° R1 og R2 er forover og bakover sekvenser av en kode
* ≥ 10 TPM

Tabell 1. Informasjon om cluster tall, gener identifisert, feilrate, prosent justering av singelen lese og koblet end biblioteker.

Utfyllende Tabell 1. Liste over alle gener og deres TPM verdier for alle prøvene, single lese og paret slutt.

Discussion

Gjeldende protokoller for å gjøre sammen end biblioteker krever mellom 1 mikrogram ⁹ til 2,5 mikrogram ¹⁰ begynner mengden av total RNA. Her presenterer vi våre lineær T7 forsterkning basert (T7LA)-metoden for å forberede både enkelt lese og koblet slutten Illumina sekvensering biblioteker og viser at denne metoden gjør generasjonen av biblioteker fra så lite som 10 ng total RNA, produsere data som er sammenlignbar med minimalt forsterket (MinAmp) biblioteker laget fra 1000 ganger mer utgangsmaterialet (10 mikrogram total RNA). De 10 ng bibliotekene ikke bare identifisere lik totalt antall gener, men også produsere genekspresjonssignaturer som ligner (figur 3a og b). Dessuten både enkelt lese og koblet end biblioteker produsert av T7LA metoden er svært like hverandre (figur 3c), som tillater forskerne å sammenligne data generert av biblioteker laget fra enten protokollen. Siden disse bibliotekene var forberedt fra humane embryonale stamceller RNA, søkte vifor 30 stamcelleforskningen spesifikke gener blant bibliotekene og finner ut at nesten alle av disse genene (93-100%) er identifisert av biblioteker laget av minst 10 ng start total RNA (figur 4), og dermed validere vår protokoll. Vi tror at vår protokoll ville være svært nyttig for forskere, særlig i forhold som flyt sorteres celler eller laser-micro-dissekert vev hvor utgangsmaterialet er begrensende. Under slike omstendigheter, ville vår protokoll tillate generasjon av genuttrykk data sammenlignes med biblioteker laget fra mye større start mengder siden vår protokoll produserer uttrykk profiler sammenlignbare på tvers av minst 3 størrelsesordener av å starte RNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fragmentation reagent	Ambion	AM8740
Liner Acrylamide	Ambion	AM9520
MEGAscript T7 Kit	Ambion	AM1334
Non DEPC treated nuclease free water	Ambion	AM9932
dNTP set	Fermentas	R0181
methylated dNTPs	Fermentas	R0431	For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5	Illumina	GD-203-5001	For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles	Illumina	FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit	Illumina	IP-102-1001	For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5	Illumina	PE-203-5001	For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit	Illumina	PE-102-1001	For paired end sample prep only
1kb plus ladder	Invitrogen	10787-018
E. coli Rnase H	Invitrogen	18021-014
Rnase Out	Invitrogen	10777-019
2nd strand buffer 5x	Invitrogen	10812-014
E. coli DNA polymerase	Invitrogen	18010-017
E-gel SYBR safe 2%	Invitrogen	G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080-085
Trizol	Invitrogen	12183555
RNA quibit assay kit	Invitrogen	Q32852
dsDNA HS qubit assay kit	Invitrogen	Q32851
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
T4 DNA Polymerase	Invitrogen	18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water	Invitrogen	10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit	Invitrogen	11917-020
Random Primer (invitrogen)	Invitrogen	48190-011	For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer	IDT	N/A	For Single Read sample prep only
Oligo dT T7	IDT	N/A
Not1 digestion kit	New England Biolabs	R0189S	For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit	Qiagen	74204
RNEasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104
Gel purification kit	Qiagen	28604
Dnase set	Qiagen	79254
Rneasy MinElute kit	Qiagen	74204
DNA clean and concentrator (250X)	Zymo Research Corp.	D4014