Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع

Published: October 27, 2011 doi: 10.3791/3340
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1,2,3, 1, 1
1Regenerative Biology, Morgridge Institute for Research, 2Department of Cell & Regenerative Biology, University of Wisconsin, 3Department of Molecular, Cellular, & Regenerative Biology, University of California

Summary

نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية تمثل النصوص كلها.

Abstract

يستخدم الآن كله التسلسل transcriptome بواسطة تسلسل - مرنا على نطاق واسع لأداء عالمية التعبير الجيني ، الطفرة ، أليل محددة التعبير وغيرها من التحليلات الجينوم واسعة. تسلسل مرنا ، حتى يفتح الباب لتحليل التعبير الجيني للمورثات غير متسلسلة. مرنا ، يقدم تسلسل حساسية عالية ، ومجموعة كبيرة ديناميكية ويسمح بقياس الأرقام نسخ النص في العينة. البورشيد في الجينوم محلل يؤدي تسلسل لعدد كبير (> 10 7) من سلسلة قصيرة نسبيا يقرأ (<150 BP) ، والتسلسل و"إقران نهاية" النهج ، وفيه قراءة واحدة طويلة في كل أهدافها ، ويسمح لتعقب التقاطعات لصق بديل ، الإدراج والحذف ، ومفيد لتجميع دي transcriptome نوفو.

واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الباحثين هو كمية محدودة من المواد ابتداء. على سبيل المثال ، في التجارب حيث يتم حصاد الخلايا بواسطة الليزر الدقيقة تشريح المتاحة بدءا مجموع RNA مالمنعم يوسف في قياس نانوجرام. وقد وصفت إعداد تسلسل مرنا - المكتبات من مثل هذه العينات 1 ، 2 ولكن ينطوي كبيرة PCR التضخيم التي قد أعرض عن التحيز. وقد نشرت الأخرى بناء مكتبة الرنا تسلسل الإجراءات مع الحد الأدنى من التضخيم PCR 3 ، 4 ، ولكنها تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ابتداء الإجمالي.

نحن هنا وصف بروتوكول لمنصة الجينوم محلل البورشيد الثاني لتسلسل تسلسل مرنا ، لإعداد المكتبة التي تتجنب كبيرة PCR التضخيم ويتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي الإجمالي. في حين وصفت في وقت سابق هذا البروتوكول والمصادقة على واحد في نهاية التسلسل 5 ، حيث تم عرض لانتاج مكتبات الاتجاه دون إدخال كبيرة التحيز التضخيم ، نحن هنا من صحة أكثر من ذلك لاستخدامها بوصفها بروتوكول نهاية المقترنة. نحن تضخيم انتقائي الرناوات رسول مذيل بعديد الأدينيلات بدءا من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الأسلوب يستند T7 Eberwine التضخيم الخطية ، صاغ "T7لوس انجليس "(T7 خطية التضخيم) ، وتضخيم بولي - A مجزأة mRNAs ، عكس كتب ومحول ligated لإنتاج مكتبة التسلسل النهائي. بالنسبة لكل من يعمل واحد نهاية القراءة والمقترنة ، يتم تعيينها لسلاسل transcriptome الإنسان (6) وتطبيع بحيث ويمكن مقارنة البيانات من تشغيل متعددة ، ونحن التقرير قياس التعبير الجيني في وحدات من النصوص لكل مليون (TPM) ، وهو مقياس متفوقة على RPKM عند مقارنة عينات 7.

Protocol

1. عزل الحمض النووي الريبي مجموع

  1. إضافة إلى خلايا 1ml Trizol / الأنسجة ، والتجانس مع إبرة 18-22 الشاش إذا لزم الأمر.
  2. إضافة 200 ميكروليتر كلوروفورم ، وتدور بسرعة 14000 دورة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. تأخذ بها الطبقة المائية العليا ، إضافة 0.5 ميكروليتر الأكريلاميد الخطية ، ثم إضافة 500 الأيزوبروبانول ميكرولتر. دعونا نجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  4. تدور في 14000 دورة في الدقيقة 4 درجات مئوية في غسل بيليه ، مع الايثانول 70 ٪ ، وفراغ الجافة.
  5. 1 Resuspend في المياه nuclease ميكرولتر حرة ونقل أنبوب إلى 200 PCR ميكرولتر.

2. اعداد الذين تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا]

  1. في الحمض النووي الريبي (1) أعلاه ميكرولتر إضافة 1 ميكرولتر من 100 ميكرون بنسبة ضئيلة من DT - T7 التمهيدي النسخ العكسي (5' - GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 ") ، والحرارة بلغت 70 درجة مئوية (كتلة الحرارة) لمدة 5 دقائق ، والمفاجئة باردة على الجليد.
  2. إضافة 1 ميكروليتر العازلة FS 5X ، 0.5 DTT ميكرولتر ، 0.5 مزيج dNTP ميكرولتر و 0.5 RnaseOUT ميكروليتر (من المجموعة الثانية مرتفع).
  3. الحرارة إلى 42درجة مئوية في جهاز PCR لمدة 1 دقيقة ، ثم يضاف 0،5 ميكروليتر عكس المنتسخة الثاني مرتفع. احتضان لمدة 1 ساعة على 42 درجة مئوية.
  4. الحرارة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ، باردة إلى 4 درجة مئوية.
  5. على الجليد ، إضافة إلى ما يلي ردود الفعل المذكورة أعلاه :
  • Nuclease مجانا المياه -- 22.75 ميكرولتر
  • 5X العازلة حبلا الثانية -- 7.5 ميكروليتر
  • dNTP مزيج -- 0.75 ميكروليتر
  • كولاي DNA يغاز -- 0.25 ميكروليتر
  • هاء بوليميريز الحمض النووي القولونية -- 1 ميكروليتر
  • RnaseH -- 0.25 ميكروليتر

احتضان لمدة 2 ساعة على 16 درجة مئوية ثم تضاف 1 ميكروليتر البلمرة DNA T4 ، واحتضان لمدة 10 دقائق إضافية عند 16 درجة مئوية.

  1. نقل إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف ، وإضافة الماء 80 ميكرولتر.
  2. إضافة 0.5 ميكرولتر من الأكريلاميد الخطية.
  3. إضافة 72 ميكرولتر 3 M NH4OAc و 480 ميكرولتر من البرد الإيثانول بنسبة 100 ٪. 1 ساعة ليعجل في -20 درجة مئوية.
  4. تدور في 14000 دورة في الدقيقة عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ويغسل مع مل ايثانول 1 70 ٪ ، الطرد المركزي في 14000 دورة في الدقيقة لمدة 2دقائق ، وفراغ الجافة لمدة 10 دقائق تقريبا.

3. تضخيم بولي - A مرنا في النسخ التي كتبها المختبر

  1. Resuspend أعلاه [كدنا] في 3.5 ميكروليتر nuclease المياه مجانا.
  2. إلى ما سبق ، إضافة 1 ميكروليتر كل من dNTPs (المجموع 4 ميكرولتر) ، 1 ميكرولتر من رد فعل العازلة 10X و 1 ميكرولتر من بوليميريز T7 ، و 0.5 ميكرولتر من RnaseOUT من عدة Megascript.
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية في جهاز PCR بين عشية وضحاها.
  4. جاهزة للخطوة التالية. يمكن تخزينها في -80 درجة مئوية.

4. تجزئة وبولي تضخيم مرنا

  1. إضافة 26 ميكروليتر من الماء لردود الفعل المذكورة أعلاه و 4 ميكروليتر كاشف تجزئة 10X.
  2. الحرارة في جهاز PCR في 70 درجة مئوية لمدة 7 دقائق بالضبط.
  3. إضافة 5 ميكرولتر من العازلة وقف التشرذم ، وضعت العينة على الجليد.

5. RNA تنظيف

  1. للتفاعل أعلاه ، إضافة 60 ميكرولتر المياه و 350 ميكرولتر من RLT العازلة من مجموعة MinElute Rneasy ، ومزيج من قبل pipetting.
  2. إضافة 250 ميكروليتر الإيثانول ، مزيج من قبل pipetting ، وماصة في عمود الدوران.
  3. تدور في إطار التعاون الإقليمي 8000 لمدة 20 ثانية.
  4. يغسل مرة واحدة مع RPE ، وتدور لمدة 20 ثانية ، ويغسل مرة ثانية مع EtOH 80 ٪ ، وتدور لمدة 2 دقيقة ، وعمود الدوران الجافة مع 5 دقيقة.
  5. أزل الحمض النووي الريبي في 10 ميكرولتر nuclease المياه مجانا.

6. [كدنا] توليف

أول التوليف حبلا للمكتبة واحدة نصها كما يلي :

  1. في أنبوب PCR ، إضافة ما يلي :
  • مجزأة بولي - A مرنا -- 10 ميكروليتر
  • NOTI التمهيدي nonamer عشوائية -- 1 ميكروليتر

في احتضان 70 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في thermocycler ، والبرد سريعة على الجليد. NOTI Nonamer التمهيدي (5' - TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 "). تسلسل 5 'القريبة من موقع التقييد NOTI بينما التسلسل التالي حتى المنطقة العشوائية هو تكملة عكس البورشيد في تسلسل محول B - شريحة من تسلسل عدة.

إلى ما سبق ، إضافة التالية على الجليد (من المجموعة الثالثة مرتفع) :
  • 5X العازلة حبلا ميكرولتر -4 first
  • DTT -- 2 ميكروليتر
  • * خليط dNTP -- 1.5 ميكروليتر

وضعت على thermocycler لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة 42 درجة مئوية ، إضافة 1 ميكرولتر من المنتسخة مرتفع عكس الثالث ، واحتضان عند درجة 42 ل1hr.

* وبدلا من dCTP ، كان 5 ميثيل dCTP في الخليط dNTP.

أول التوليف حبلا للمكتبة نهاية الاقتران :

  1. في أنبوب PCR ، إضافة ما يلي :
  • مجزأة بولي - A مرنا -- 10 ميكروليتر
  • عشوائي التمهيدي مسدوس -- 1 ميكروليتر

في احتضان 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في thermocycler ، والبرد سريعة على الجليد.

  1. إلى ما سبق ، إضافة التالية على الجليد (مرتفع من عدة firststrand الثالث) :
  • 5X العازلة حبلا الأول -- 4 ميكروليتر
  • DTT -- 2 ميكروليتر
  • dNTPs (من الطقم) -- 1.5 ميكروليتر

وضعت على لthermocycler 1 دقيقة بمعدل 45 درجة مئوية ، إضافة 1 ميكرولتر من المنتسخة مرتفع عكس الثالث ، واحتضان عند 45 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.

حبلا التوليف الثانية (لكل من المكتبات) :

  1. إلى ما سبق ، إضافة التالية على الجليد (من المجموعة الثانية مرتفع) :
  • المياه (ريبونوكلياز مجاني) -- 91 ميكروليتر
  • 5X الاحتياطي ستراند ثانيا -- 30 ميكروليتر
  • dNTPs (من مجموعة) -- 3 ميكروليتر
  • كولاي DNA يغاز -- 1 ميكروليتر
  • هاء بوليميريز الحمض النووي القولونية -- 4 ميكروليتر
  • كولاي ريبونوكلياز H -- 1 ميكروليتر

أنبوب المزيج بواسطة انقلاب ، وإعطاء تدور قصيرة واحتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

7. تنقية [كدنا]

  1. تنقية عينة [كدنا] مع الأعمدة الإنزيم ، أزل في 40 ميكرولتر من المياه للقراءة واحدة و 30 ميكروليتر من الماء لمكتبة نهاية المقترنة.

8. نهاية إصلاح

لمكتبة واحدة نصها كما يلي :

معشوقة = "jove_content"> (استخدم البورشيد رقاقة تسلسل عينة الإعدادية الطقم)

  1. إلى ميكرولتر 40 أعلاه من [كدنا] ، يضاف ما يلي :
  • T4 العازلة يغاز الحمض النووي مع ATP 10MM -- 5 ميكرولتر
  • dNTP مزيج -- 2 ميكروليتر
  • T4 بوليميريز الحمض النووي -- 1 ميكروليتر
  • Klenow انزيم (01:05 المخفف بالماء ل1U / ميكرولتر) -- 1 ميكروليتر
  • T4 PNK -- 1 ميكروليتر

في احتضان cycler الحرارية لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية.

لمكتبة نهاية الاقتران :

(استخدم نموذج البورشيد نهاية الاقتران الإعدادية الطقم)

  1. إلى ميكرولتر 30 أعلاه [كدنا] ، إضافة :
  • ريبونوكلياز الدناز المياه مجانا -- 45 ميكروليتر
  • T4 العازلة يغاز الحمض النووي مع ATP 10MM -- 10 ميكروليتر
  • 10MM dNTP مزيج -- 4 ميكروليتر
  • T4 بوليميريز الحمض النووي -- 5 ميكرولتر
  • Klenow انزيم -- 1 ميكروليتر
  • T4 PNK -- 5 ميكرولتر

في احتضان cycler الحرارية لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية.

9. تنظيف [كدنا]

  1. C العجاف حتى [كدنا] الإنزيم باستخدام الأعمدة. أزل في 34 ميكرولتر من المجلس التنفيذي للقراءة واحدة و 32 ميكرولتر من المجلس التنفيذي للمكتبة نهاية المقترنة.

10. إضافة قواعد "أ" لانهاء 3 'من شظايا الحمض النووي

لمكتبة واحدة نصها كما يلي :

  1. تحضير مزيج التفاعل التالي :
  • عينة من الحمض النووي -- 34 ميكروليتر
  • Klenow العازلة -- 5 ميكرولتر
  • dATP -- 10 ميكروليتر
  • Klenow EXO -- 1 ميكروليتر

احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

لمكتبة نهاية الاقتران :

  1. تحضير مزيج التفاعل التالي :
  • عينة من الحمض النووي -- 32 ميكروليتر
  • Klenow العازلة -- 5 ميكرولتر
  • dATP -- 10 ميكروليتر
  • Klenow EXO -- 3 ميكروليتر

احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.

11. تنظيف [كدنا]

  1. تنظيف [كدنا] الإنزيم باستخدام الأعمدة. أزل في 10 ميكرولتر من المجلس التنفيذي.

12. محول ربط

jove_step "> للحصول على واحد مكتبة نصها كما يلي :

(استخدام البورشيد رقاقة تسلسل عينة الإعدادية الطقم)

  1. تحضير مزيج التفاعل التالي :
  • عينة من الحمض النووي -- 10 ميكروليتر
  • محول أليغو ميكس -- 1 ميكروليتر
  • 2X DNA يغاز العازلة -15 ميكرولتر
  • الحمض النووي يغاز -- 4 ميكروليتر

احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. وينبغي على إذابة الجليد ومحولات 01:20 مخففة.

لمكتبة نهاية الاقتران :

(استخدم نموذج البورشيد نهاية الاقتران الإعدادية الطقم)

  1. تحضير مزيج التفاعل التالي :
  • عينة من الحمض النووي -- 10 ميكروليتر
  • PE ميكس أليغو محول -- 10 ميكروليتر
  • 2X الاحتياطي يغاز الحمض النووي -- 25 ميكروليتر
  • الحمض النووي يغاز -- 5 ميكرولتر

احتضان لمدة 15 دقيقة عند 20 درجة مئوية. وينبغي على إذابة الجليد ومحولات 01:20 مخففة.

13. رد فعل ربط تنظيف

  1. تنظيف تفاعل الربط باستخدام ZYأعمدة مو. أزل في 44 ميكروليتر من الماء لمكتبة واحدة للقراءة و 6 ميكرولتر من EB تليها أخرى في 5 ميكرولتر شطف للمجلس التنفيذي للمكتبة نهاية المقترنة.

تنفيذ عملية الهضم NOTI ، فقط قراءة واحدة لمكتبة

  • [كدنا] -- 44 ميكروليتر
  • NEB العازلة 3-5 ميكرولتر
  • جيش صرب البوسنة -- 0.5 ميكروليتر
  • NOTI -- 1 ميكروليتر

احتضان لمدة 2 ساعة ليلة وضحاها في 37 درجة مئوية ، وردود الفعل تنقية الإنزيم باستخدام العمود. ثم أزل مع 6 ميكرولتر من EB العازلة من قبل شطف الثاني برصيد 5 ميكرولتر من المجلس التنفيذي.

14. اختيار حجم / جل تنقية

نفذ ما يلي باستخدام Sybr الآمن E - 2 ٪ من جل Invitrogen.

  1. تشغيل برنامج PreRun 0 - 2 دقيقة.
  2. تحميل زائد 1KB سلم من 01:04 Invitrogen الواحد ، وتحميل 10 ميكرولتر.
  3. تحميل كل عينة الحمض النووي ، وملء الممرات فارغة ب 10 ميكروليتر من الماء.
  4. تشغيل برنامج 1 - 2 ٪ EGel تشغيل 28 دقيقة.
  5. حدد حجم 200-300 غليان هلام SLICه بشفرة حلاقة جديدة.

15. أزل شريحة الحمض النووي من هلام

  1. شريحة تزن هلام ، وإضافة 3 مجلدات من العازلة QG إلى 1 حجم هلام (جل استخلاص مجموعة من استخدام Qiagen)
  2. احتضان عند 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة أو حتى شريحة جل يذوب.
  3. إضافة 1 حجم ispropanol ، ومزيج من قبل انقلاب أو pipetting.
  4. إضافة إلى زيادة ونقصان ، العمود لمدة 1 دقيقة في السرعة القصوى ، وتجاهل من خلال تدفق.
  5. إضافة 500 ميكرولتر من الاحتياطي QG إلى العمود ، وتدور لمدة 1 دقيقة في السرعة القصوى ، وتجاهل من خلال تدفق.
  6. إضافة 750 ميكرولتر من البولي ايثيلين الاحتياطي إلى العمود ، وتدور لمدة 1 دقيقة في السرعة القصوى ، وتجاهل من خلال تدفق.
  7. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في أقصى سرعة.
  8. أزل في 36 ميكرولتر من المجلس التنفيذي للقراءة واحدة و 23 EB ميكرولتر لمكتبة نهاية المقترنة.

16. PCR

لمكتبة واحدة نصها كما يلي :

(استخدام البورشيد رقاقة تسلسل عينة الإعدادية الطقم)

  1. تعد الى ما يلي :ز مزيج تفاعل PCR :
  • الحمض النووي -- 36 ميكروليتر
  • 5X العازلة Phusion -- 10 ميكروليتر
  • dNTP مزيج -- 1.5 ميكروليتر
  • PCR التمهيدي 1،1-1 ميكرولتر
  • PCR التمهيدي 2،1-1 ميكرولتر
  • بوليميريز Phusion -- 0.5 ميكروليتر

استخدم ما يلي PCR البروتوكول :

  • 30 ثانية في 98 درجة مئوية
  • 10 دورات :
    • 10 ثانية عند 98 درجة مئوية
    • 30 ثانية في 65 درجة مئوية
    • 30 ثانية عند 72 درجة مئوية
  • 5 دقائق عند 72 درجة مئوية
  • عقد في 4 درجات مئوية

* في المرة الأولى التي يتم استخدام هذه المجموعة ، تمييع PCR الاشعال 01:02 العازلة مع EB.

لمكتبة نهاية الاقتران :

(استخدم نموذج البورشيد نهاية الاقتران الإعدادية الطقم)

  1. إعداد رد فعل PCR التالية :
  • الحمض النووي -- 23 ميكروليتر
  • Phusion بوليميريز الحمض النووي -- 25 ميكروليتر
  • PCR التمهيدي PE 1،1-1 ميكرولتر
  • PCR التمهيدي PE 2.1 --1 ميكروليتر

تضخيم PCR باستخدام بروتوكول التالية :

  1. 30 ثانية في 98 درجة مئوية
  2. 10 دورات :
    • 10 ثانية عند 98 درجة مئوية
    • 30 ثانية في 65 درجة مئوية
    • 30 ثانية عند 72 درجة مئوية
  3. 5 دقائق عند 72 درجة مئوية
  4. عقد في 4 درجات مئوية

* في المرة الأولى التي يتم استخدام هذه المجموعة ، تمييع PCR الاشعال 01:02 العازلة مع EB.

17. مكتبة تنظيف

  1. تنظيف المكتبة باستخدام أعمدة الإنزيم. أزل في 12 ميكرولتر من EB

18. مكتبة Quantitate

  1. Quantitate المكتبة باستخدام و qubit. انها مستعدة لالتسلسل. استخدام التسلسل الاشعال من قراءة واحدة البورشيد العنقودية عدة V4 جيل واحد أو أكثر للقراءة ومكتبة البورشيد العنقودية نهاية إقران عدة الجيل V4 أو أعلى للمكتبة نهاية المقترنة.

19. تحليل البيانات

وقد استخدم ربطة 6 إلى مأب يقرأ لمجموعة الجينات RefSeq (NCBI بناء 36.1). نهاية واحد يقرأ (30 النيوكليوتيدات) ونهاية يقرأ الزوج (42 النيوكليوتيدات) تم تعيين السماح تصل إلى 10 مباراة على مجموعة الجينات ، والسماح ليصل الى اثنين من عدم التطابق في القراءة. وتم الحصول على نسخ لكل القيم (TPM) مليون لقياس التعبير الجيني باستخدام RSEM 7 (تسلسل الحمض النووي الريبي ، من خلال تعظيم - التوقع).

20. نتائج ممثل : حققنا المكتبات T7LA نهاية واحدة لكل من القراءة وإقران تمتد من 1 ميكروغرام ، ميكروغرام 100 ميكروغرام 10 ، ميكروغرام 1 و ص 100 مجموع بدءا RNA (الشكل 1). لتقييم بروتوكول لدينا ، قدمنا ​​قراءة واحدة والمقترنة مكتبات نهاية دون تضخيم الحمض النووي الريبي RNA T7 بدءا من 10 ميكروغرام مجموع هذه المكتبات السيطرة ، ووصف "MinAmp" ، والتضخيم الحد الأدنى. التضخيم إلا أنها تخضع لدورات 10 من PCR قرب نهاية البروتوكول لligate محولات البورشيد التسلسل ، وهي خطوة مشتركة لجميع المكتبات. وقد تم عزل كل من الحمض النووي الريبي تستخدم H14الخلايا الجذعية الجنينية البشرية 8.

أولا قمنا بتقييم عدد من الجينات التي تم تحديدها من قبل مختلف مكتبات (الجدول 1 والجدول التكميلي 1). لكل من المكتبات واحدة نهاية القراءة والاقتران ، حدد 10 نانوغرام المكتبات T7LA تقريبا نفس عدد الجينات في المكتبات ميكروغرام MinAmp 10 ، مع TPM من 10 أو أكثر. في حالة واحدة من مكتبات القراءة ، وحددت 10 نانوغرام T7LA مكتبة 100 ٪ من الجينات التي تم تحديدها من قبل 8500 ميكروغرام مكتبة unamplified 10. للمكتبات نهاية الاقتران ، حدد 10 نانوغرام T7LA المكتبة 86 ٪ من الجينات التي تم تحديدها من قبل مكتبة ميكروغرام unamplified 10 (7961 9267 من الجينات). وكانت المكتبات مصنوعة من أقل من 10 نانوغرام غير قادرة على تحديد والعديد من الجينات. على سبيل المثال ، في البروتوكول قراءة واحدة ، حدد مكتبة نانوغرام فقط 1 ~ 50 ٪ من الجينات التي تم تحديدها من قبل مكتبة ميكروغرام MinAmp 10 ، الأمر الذي دفعنا إلى الحد الأدنى من المبلغ الإجمالي للاستخدام الحمض النووي الريبي مع بروتوكول T7LA إلى 10 نانوغرام. وعلاوة على ذلك ، ورسم خرائط الجينات التدبير المنزلي ، GAPDH (الشكل 2) يدل على ان جميع المكتبات التي T7LA على الأقل ابتداء من الحمض النووي الريبي 10ng تحديد جميع exons متماثلة ، بما في ذلك اكسون ال 5 المدقع. مقارنة بين 10 نانوغرام واحد T7LA نهاية القراءة والمكتبات المقترنة مع مكتبات MinAmp يظهر درجة عالية من التشابه (سبيرمان الارتباط ، R = 0،90 و 0،95 على التوالي ، والأرقام 3A ب). قارنا أيضا وهما واحد المكتبات نهاية القراءة وإقران مصنوعة من الحمض النووي الريبي إجمالي 10 نانوغرام وكان لديهم معامل الارتباط عالية جدا (R = 0.92) ، مما يدل على أن كلا النوعين من المكتبات التي تستخدم بروتوكول T7LA إنتاج التعبير الجيني مشابهة جدا التوقيع ( الرقم 3C). وبالتالي ، فإن أسلوب T7LA هي قادرة على انتاج مكتبات التسلسل التي يعول عليها وشاملة مثل المكتبات MinAmp ، ولكن من 1000 أضعاف المواد أقل الانطلاق.

الشكل 1
الشكل 1 مخطط نهاية الاقتران وإعداد مكتبة واحدة بروتوكول القراءة.

jove_content "> الشكل 2
الشكل 2 صورة المتصفح جينوم الجين التدبير المنزلي ، GAPDH ، بالنسبة لجميع المكتبات واحدة نهاية القراءة والمقترنة. شريط النطاق على اليسار للمكتبات واحد يشير إلى قراءة 350 مجموع القراءات. شريط النطاق في مركز للمكتبات نهاية الاقتران يشير إلى مجموع القراءات 5000. المحور الأفقي يمثل تسلسل جينوم GAPDH.

الشكل 3
الشكل 3 الارتباط أشكال التعبير الجيني بين المكتبات المختلفة (سبيرمان ل) : بين ألف واحد يقرأ 10 و 10 نانوغرام T7LA مكتبة MinAmp ميكروغرام يظهر أن كلا من هذه المكتبات لديها التعبير الجيني مشابهة جدا نمط (R = 0.90) باء بين نهاية الاقتران 10 و 10 نانوغرام T7LA مكتبة MinAmp ميكروغرام تشابهها يوضح ملامح التعبير الجيني (R = 0.95). جيم الارتباط السابقين الجينpressions بين نهاية نانوغرام 10 و 10 نانوغرام إقران المكتبات قراءة واحدة تدل على درجة عالية من التشابه بين هذه المكتبات التي أعدتها أسلوب T7LA (R = 0.92).

الشكل 4
الشكل 4 تحديد الجذعية الجنينية البشرية genes5 خلية معينة من جميع المكتبات واحدة نهاية القراءة والمقترنة.

مكتبة اكتب ° خام الكتل الكتل تمرير تصفية ٪ ٪ محاذاة إلى جينوم ٪ معدل خطأ الجينات التي تم تحديدها
MinAmp 10ug قراءة واحدة 225602 + / -- 4952 65.48 + / -- 2.58 47.61 + / -- 0.53 0.62 + / -- 0.06 8500
1ug T7LA قراءة واحدة 144818 + / -- 6513 82.21 + / -- 6.45 48.09 + / -- 0.27 0.42 + / -- 0.03 8757
100ng T7LA قراءة واحدة 27385 + / -- 1818 81.33 + / -- 11.75 44.46 + / -- 4.53 0.49 + / -- 0.10 8709
10ng T7LA قراءة واحدة 11184 + / -- 985 60.70 + / -- 3.70 14.96 + / -- 1.15 0.99 + / -- 0.30 8589
1ng T7LA قراءة واحدة 12695 + / -- 1365 53.27 + / -- 16.76 4.08 + / -- 0.79 2.25 + / -- 1.56 4720
100pg T7LA قراءة واحدة 10390 + / -- 1398 72.99 + / -- 2.90 1.48 + / -- 0.20 1.51 + / -- 0.39 1121
MinAmp 10ug إقران نهاية R1 95786 + / -- 12937 90.77 + / -- 2.79 58.50 + / -- 0.95 0.94 + / -- 0.38 9267
إقران نهاية R2 95786 + / -- 12937 90.77 + / -- 2.79 58.13 + / -- 1.13 0.99 + / -- 0.37
1ug T7LA إقران نهاية R1 297669 + / -- 10196 91.35 + / -- 0.36 46.89 + / -- 0.14 0.47 + / -- 0.01 7334
إقران نهاية R2 297669 + / -- 10196 91.35 + / -- 0.36 45.52 + / -- 0.12 0.51 + / -- 0.01
100ng T7LA إقران نهاية R1 205602 + / -- 9932 90.53 + / -- 0.76 63.44 + / -- 1.00 0.48 + / -- 0.02 8011
إقران نهاية R2 205602 + / -- 9932 90.53 + / -- 0.76 61.80 + / -- 8.09 0.60+ / -- 0.36
10ng T7LA إقران نهاية R1 214622 + / -- 11155 89.98 + / -- 1.13 56.32 + / -- 1.94 0.80 + / -- 0.26 7961
إقران نهاية R2 214622 + / -- 11155 89.98 + / -- 1.13 46.41 + / -- 18.39 2.48 + / -- 2.68 ؛
1ng T7LA إقران نهاية R1 144951 + / -- 19841 90.54 + / -- 1.19 3.91 + / -- 0.16 8.71 + / -- 0.86 8124
إقران نهاية R2 144951 + / -- 19841 90.54 + / -- 1.19 3.27 + / -- 1.21 9.11 + / -- 3.52
100pg T7LA إقران نهاية R1 187600 + / -- 11759 89.52 + / -- 1.11 1.78 + / -- 0.05 13.42 + / -- 0.50 6623
إقران نهاية R2 187600 + / -- 11759 89.52 + / -- 1.11 1.99 + / -- 0.23 15.29 + / -- 0.96

° R1 و R2 وإلى الأمام وعكس تسلسل علامة
* ≥ 10 TPM

الجدول 1. معلومات عن أرقام الكتلة ، الجينات التي تم تحديدها ، ومعدل الخطأ ، والمحاذاة في المئة من المكتبات واحدة نهاية القراءة والمقترنة.

الجدول التكميلي 1. قائمة لجميع الجينات والقيم TPM من أجل جميع العينات ، وقراءة واحدة والمقترنة الغاية.

Discussion

البروتوكولات الحالية لجعل المكتبات نهاية الاقتران تتطلب ما بين 1 ميكروغرام 9-2،5 10 ميكروغرام كمية بدءا من الحمض النووي الريبي الإجمالي. نحن هنا حاضرنا التضخيم T7 خطية إلى (T7LA) طريقة واحدة لإعداد كلا البورشيد نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التسلسل وتبين أن هذا الأسلوب يسمح للمكتبات من الجيل منخفضة تصل إلى 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إنتاج البيانات التي يمكن أن تقارن من تضخيم الحد الأدنى (MinAmp) مصنوعة من مواد المكتبات أضعاف بدءا من 1000 (10 ميكروغرام RNA المجموع). المكتبات 10 نانوغرام لم يحدد فقط العدد الإجمالي للجينات مماثلة ، ولكن أيضا إنتاج التوقيعات التعبير الجيني التي تشبه (أرقام 3a و ب). وعلاوة على ذلك ، فإن كلا من واحدة نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التي تنتجها T7LA طريقة مشابهة جدا لبعضها البعض (الشكل 3C) ، الذي يسمح للباحثين لمقارنة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل المكتبات إما مصنوعة من البروتوكول. منذ أعدت هذه المكتبات من الحمض النووي الريبي الجنينية البشرية الخلايا الجذعية ، بحثنالمدة 30 جينات الخلايا الجذعية محددة بين المكتبات وجدت أن ما يقرب من تحديد جميع هذه الجينات (93-100 ٪) من المكتبات مصنوعة من لا يقل عن 10 نانوغرام من بدء RNA الكلي (الشكل 4) ، والمصادقة على البروتوكول وبالتالي لدينا. نعتقد بروتوكول لدينا ستكون مفيدة جدا للباحثين ، وخاصة في ظروف مثل الخلايا التي تم فرزها أو تدفق الليزر الدقيقة تشريح الأنسجة حيث بدأ يحد من المواد. في مثل هذه الظروف ، سيكون لدينا بروتوكول يسمح توليد بيانات قابلة للمقارنة في التعبير الجيني للمكتبات مصنوعة من كميات أكبر من ذلك بكثير منذ بدء بروتوكول لدينا تنتج ملامح التعبير للمقارنة بين ما لا يقل عن 3 أوامر من حجم بدءا من الحمض النووي الريبي.

Disclosures

الكتاب يكشف ان جات هو مؤسس ، حاملي الأسهم ، ومستشار وعضو مجلس الخلوية حيوية الدولية (CDI). وهو يشغل أيضا منصب المستشار العلمي لديها مصالح مالية والثانية في المشاريع التكتيك الخلايا الجذعية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعهد Morgridge للبحوث وجامعة ولاية ويسكونسن مؤسسة. نشكر كريستا إيستمان للمساعدة التحرير.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fragmentation reagent Ambion AM8740
Liner Acrylamide Ambion AM9520
MEGAscript T7 Kit Ambion AM1334
Non DEPC treated nuclease free water Ambion AM9932
dNTP set Fermentas R0181
methylated dNTPs Fermentas R0431 For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5 Illumina GD-203-5001 For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles Illumina FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit Illumina IP-102-1001 For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5 Illumina PE-203-5001 For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit Illumina PE-102-1001 For paired end sample prep only
1kb plus ladder Invitrogen 10787-018
E. coli Rnase H Invitrogen 18021-014
Rnase Out Invitrogen 10777-019
2nd strand buffer 5x Invitrogen 10812-014
E. coli DNA polymerase Invitrogen 18010-017
E-gel SYBR safe 2% Invitrogen G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) Invitrogen 18080-085
Trizol Invitrogen 12183555
RNA quibit assay kit Invitrogen Q32852
dsDNA HS qubit assay kit Invitrogen Q32851
E. coli DNA ligase Invitrogen 18052-019
T4 DNA Polymerase Invitrogen 18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water Invitrogen 10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit Invitrogen 11917-020
Random Primer (invitrogen) Invitrogen 48190-011 For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer IDT N/A For Single Read sample prep only
Oligo dT T7 IDT N/A
Not1 digestion kit New England Biolabs R0189S For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit Qiagen 74204
RNEasy Mini Kit (50) Qiagen 74104
Gel purification kit Qiagen 28604
Dnase set Qiagen 79254
Rneasy MinElute kit Qiagen 74204
DNA clean and concentrator (250X) Zymo Research Corp. D4014

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
  2. Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
  3. Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
  4. Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
  5. Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
  6. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
  7. Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
  8. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  9. mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
  10. ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.

Tags

علم الأحياء الجزيئية ، العدد 56 ، علم الوراثة ، مرنا ، تسلسل ، البورشيد ، تسلسل ، التنميط الجيني التعبير ، وارتفاع إنتاجية التسلسل
قراءة واحدة المقترنة مكتبات نهاية البورشيد مرنا ، في الفترة من 10 نانوجرام تسلسل الحمض النووي الريبي مجموع
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti,… More

Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti, V., Nguyen, B. K., Thomson, J. A., Elwell, A. L., Stewart, R. Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA. J. Vis. Exp. (56), e3340, doi:10.3791/3340 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter