Summary
寄生蜂（寄生）构成了许多昆虫的天敌，包括各大类
Abstract
最知名的寄生蜂攻击的果蝇幼虫或蛹的阶段。虽然Trichopria果蝇感染主机（ 图1A-C的 ），蛹的阶段，女性的，属Leptopilina（ 图1D，1F，1G）和Ganaspis（ 图1E）攻击的幼虫。我们使用这些寄生虫，一个种族的生物武器研究的分子基础。寄生蜂有防菌的巨大价值。他们大多携带的毒力和其他因素，修改主机的生理和免疫力。分析果蝇黄蜂提供特定物种的相互作用如何塑造自然群落的遗传结构的见解。这些研究还为了解主机的免疫生理以及如何协调免疫反应，这一类寄生虫挫败模型。
幼虫/蛹的表皮，作为第一线的夏德芬SE。蜂产卵器是一个尖锐的针状结构，可有效提供主机hemocoel的鸡蛋。其次是在表皮伤口愈合反应（ 图1C，箭头）产卵。有些黄蜂可以插入同一台主机上的两个或两个以上的鸡蛋，虽然只有一个鸡蛋的开发成功。的编外鸡蛋或发展幼虫被淘汰一个尚未了解的过程。这些小蜂，因此被称为为孤寄生。
根据动态应变和蜂种，蜂卵有两种命运。它可以封装，以便其发展受阻（主机出现; 图2左）;或黄蜂卵孵化，开发，molts，生长到成年（黄蜂出现图2右）。L。 heterotoma是果蝇寄生蜂的最好研究的物种之一。这是一个“多面手”，这意味着它可以利用大多数果蝇小号的pecies作为主机1 与heterotoma和L。 victoriae是姐妹物种和它们产生的病毒样颗粒封装响应2，积极干预。与L。 heterotoma，L. boulardi是一个专业的寄生虫和果蝇的范围，它采用的是相对有限的1。株L。 boulardi也产生病毒样颗粒3，虽然他们在自己的能力成功地在 D显着不同黑 1。一些这些研究boulardi株是很难成长， 在 D动态主机1 果蝇作为经常成功地封装它们的卵。因此，重要的是要在特定的实验协议双方的合作伙伴的知识。
此外屏障组织（角质层，肠道和气管）， 果蝇幼虫有全身的细胞免疫和体液免疫反应，产生fROM功能的血细胞和脂肪体，分别。产卵由L. boulardi同时激活免疫武器1,4。流通中的血细胞被发现，在柄的人群，分段角质层下和淋巴腺。淋巴腺是一个小的背侧幼虫的造血器官。造血干细胞群，称为叶，成对排列分段沿背船只沿着动物的前后轴（ 图3A）运行。脂肪体是一个大型的多功能器官（ 图3B）。它分泌抗菌肽微生物和后生动物感染。
黄蜂感染激活免疫信号（ 图4）4。在细胞水平上，它触发的血细胞的分裂和分化。在自卫，聚集和胶囊开发感染动物hemocoel（ 图5）5,6。 ACtivated血细胞迁移向蜂卵（或黄蜂幼虫）和它周围开始形成一个胶囊（ 图5A - F）。一些血细胞聚集形成结节（ 图5G - H）。仔细分析发现，黄蜂感染引起淋巴腺叶最前，在其外围分散（ 图6C，D）的。
我们提出用电话信号转导通路元件背和Spätzle（ 图4,5,7），其目标Drosomycin（ 图6）具有代表性的数据，来说明如何在淋巴腺和hemocoel的具体变化，可以研究黄蜂感染后。这里描述的剥离协议，也能产生从主机淋巴黄蜂（ 图8）鸡蛋（或发展的黄蜂阶段）。
Protocol
整个实验的协议分为四个步骤（ 图9）。 （1）蝇蛆养殖黄蜂（2）建立感染和准备解剖动物;（3）隔离和修复主机/寄生虫结构;（4）免疫组织分析。
1。对果蝇幼虫培养黄蜂
维护黄蜂文化需要仔细规划。相对于日益增长的苍蝇，这是相当劳力密集。我们维持我们在实验室YW应变果蝇幼虫或蛹的蜂殖民地在24°C培养黄蜂保持在合适的阶段，连续源的主机，并清除“感染”瓶苍蝇出现之前，黄蜂做。黄蜂按照性别决定haplodiploid方法，因此，它是重要的雌性交配之前，他们感染的主机。
- 第1天，添加少量的新鲜前民建联相比酵母膏（1毫升的水混合在大约1活性干酵母到一个新飞食品小瓶Ğ飞食品的配方是不是关键。我们成长上corn-meal/sucrose/agar介质的苍蝇。地方50-60年轻（2-4日龄）成人YW（或其他本质上是野生型株）飞行打下48小时在24°C蛋
- 第3天，取出小瓶苍蝇。与蜂蜜下降的嗡嗡声插头内侧的小瓶放在一个时髦的插件。蜂蜜中的蒸馏水稀释2:1。
- 使用的CO 2，麻醉黄蜂和排序6-8名女性和6-8男性，大约2-3天。将它们添加到小瓶含0-48小时的旧主机。请注意，黄蜂更敏感，对CO 2比苍蝇，你可能要校准他们接触到的气体。 果蝇的研究人员不使用标准的果蝇麻醉站设计。一个很好的起点，麻醉黄蜂设置的CO 2压力大约一半需要麻醉测定苍蝇。
- 更换小瓶的嗡嗡声插头（用蜂蜜）。轻轻放置在其一侧的小瓶直到黄蜂醒来。
- 蝇的幼虫和蜂在29°C培养箱放置这些小瓶。
- 成功的感染会略有延迟pupariation。主机遭受马蜂攻击，但都能够为自己辩护（或如果他们不感染），继续发展后，正常的作息时间和成蝇从这些puparia出现以及未来的黄蜂。
- 根据蜂和温度，黄蜂eclose在25-30天。
- 从小瓶蜂在发展成蝇。
2。设立感染和准备受感染的动物解剖
在开始之前，有几个干净的玻璃或塑料培养皿中，用Pyrex解剖盘9洼地，Kimwipes，蒸馏水（在喷瓶），70％的乙醇（在喷瓶），1X PBS（在喷瓶），显微镜幻灯片，小，清洁刮刀方便。
- 设立感染，按照上述步骤1-5。根据实验，它可能需要使用主机在大致相同的发展阶段。对于这一点，egglays 2-6小时，可用于感染。
- 收获感染的幼虫（解剖免疫组织或寄生虫），成一个小的玻璃或塑料培养皿中删除蝇小瓶的内容。
- 使用体视显微镜和钳子（镊子）的罚款，精心挑选6-10幼虫，一个由一，他们先用1X PBS将陷入萧条，然后转移到水，70％的乙醇，水和1×PBS，先后。这些步骤的目的是摆脱苍蝇食物的动物，并彻底清洗和消毒其表面。冲洗水稀释乙醇和最终冲洗PBS中删除的乙醇。下面的步骤3，最好不要离开在PBS动物的时间超过10分钟。
3。隔离并修复主机/寄生虫结构
背景
幼虫淋巴腺是一个小的造血器官7。在第三幼虫龄，淋巴腺包含了前叶的一双大背船只的侧翼（ 图3A，6B，7A - D）。具有独特的细胞特性的专门区域进一步分为前叶。三种类型的细胞，浆细胞，lamellocytes，晶体细胞的祖细胞位于前叶。心包细胞分离后从较小的叶前叶。 果蝇的淋巴腺是昆虫和哺乳动物的造血8,9模型。
脂肪体是哺乳动物的肝功能类似。体液免疫反应，引发肥胖的身体下面的微生物或黄蜂感染1,4,10。如因此，独特的抗菌肽基因组合被激活肽分泌到血淋巴1。肥胖的身体，也为基层组织糖原和甘油三酯的生产和储存11。幼虫的脂肪体占用大量的hemocoel量，所以不像淋巴腺，很容易找到。现在，我们将演示如何解剖的淋巴腺和三龄幼虫的脂肪体。
在您开始之前
需要精细镊子（镊子）和乙醇清洗的载玻片。
幼虫淋巴腺清扫
- 用细镊子，选择一个流浪的第三龄幼虫在1X PBS保存。
- 放置到显微镜玻片上的幼虫。
- 使用镊子，定位与腹侧方最多的动物。
- 使用两对镊子，动物举行任一侧的后端（箭头1， 图3A）和gently拉角质层引入一个小的，在角质层表面的撕裂。
- 血淋巴中含有血细胞，肠，脂肪体将开始逃离体腔。 10微升的“pipetteman”做涂片检查，如果需要的话可以采取的淋巴。
- 口钩（箭头2， 图3A）动物右侧下配售两钳，轻轻地撕角质层。
- 将两钳嘴钩（箭头2， 图3A）和动物的左侧下方，仔细再作小的撕裂。
- 按住口动物钩，轻轻一拉角质层，对动物的后端（虽然脱皮）。
- 由于角质层被拉回，脑，脂肪体，成虫盘，唾液腺，腺胃将成为暴露出来。分离角质层是在后端，但仍会有背船只与它相连的淋巴腺。</ LI>
- 切开腺胃和移动了从淋巴腺区的。淋巴腺将下方的大脑，即使你可能无法看到它。
- 仔细逗掉体内的脂肪，肠道，唾液腺，其他结构和腺体，可坐。要小心，不能脱离环腺和位于大脑后，背船只淋巴腺。淋巴腺将定位平对显微镜幻灯片。
- 小心取出所有的其他组织的淋巴腺，直到整个腺前叶展开心包细胞决胜盘。
注：正确解剖的淋巴腺将有一对前叶和两套沿背船只后叶（ 图6B）。叶可以很容易被损坏，或从背船只可以下降。样本，因此，应非常小心处理。腺也Ĥ作为枯萎或合同的倾向。轻轻地理顺机关在其后端允许所有部件和细胞以及提交。这是特别的免疫协议的必要。
仙女人体解剖
- 蔡司1000解剖显微镜（解剖显微镜可用于任何立体声）解剖的阶段上，放置一个灯箱，使入射光通过样品传输。从第2步的三龄幼虫在200μL1×PBS显微镜幻灯片的位置。从样品的光源倾斜，使机体出现透明的，因此很容易可视其内部器官。
- 使用镊子，位置，使前到底是离你的动物。
- 使用镊子，保持角质层的幼虫其口钩左侧（箭头1， 图3B）。使用其他的镊子，轻轻地撕角质层后端的方式（ARrowhead 2， 图3B）。撕不从身体的角质层在后端。
- 非常轻柔地开始消除肠道一侧。
- 轻轻地取出大脑，成虫盘，环腺背船只运行与淋巴腺。
- 不要取出唾液腺，是因为肥胖的身躯，坚持这些腺体。
- 轻轻地去除角质层和肥胖的身体上留下的幻灯片在1X PBS。
注1：脂肪体细胞层只有一个，因此，它是非常重要的所有细胞都在同一平面上的玻片夷为平地。细胞是endopolyploid的和容易想象。一个良好的脂肪体解剖样本应保持正常的细胞接触，应该有最小的脂肪球周围的解剖样本（ 图6I的J）。
注意2：如果蜂卵保持宿主的免疫系统的影响，他们将initiat电子商务的发展，几乎立即。寄生虫（主机幼虫）的早期发育阶段，很容易从的解剖hemocoel（ 图8）。寄生虫卵或幼虫坚持以脂肪体或其他器官，或简单的玻片上，在夹层滑动。
4。免疫组织分析
- 空气干燥5-10分钟，从5-10分钟前准备4％多聚甲醛的PBS固定的脂肪体幻灯片删除1X PBS淋巴腺。每张幻灯片都可以有几个解剖染色淋巴腺。移动与固定样本后续步骤加湿室自制幻灯片。这个会议厅准备把两片折叠的湿纸巾，在一个空塑料微量提示框的底部。举行的提示使用分压器的顶部可放置一个或多个幻灯片样本。
- 正因为如此，按照标准方法进行免疫组织分析结合在体内的细胞标记和间接免疫组化4。
5。代表结果
- 黄蜂感染激活Toll途径记者Drosomycin-GFP（ 图6G的J）的表达。在这个实验中基因表达的影响，黄蜂为患是在体内使用的GFP记者联系到DRS启动12可视化。在未受感染的控制动物，没有检测到GFP的表达。 GFP信号清楚地发现，从研究与感染的动物脂肪体细胞的细胞核，细胞质和解剖victoriae。为了取得最好的结果，黄蜂的比例：主机应该是1:10。感染应持续至少2个小时。后为患，DRS-GFP信号的加剧和许多脂肪体细胞的GFP阳性，甚至长达72个小时1,4。
- 黄蜂感染诱导分化的lamellocytes在Lymph腺（ 图6D）。 lamellocytes包围和封锁黄蜂发展（ 图6H）。淋巴腺解剖可视化研究后前叶诱导细胞的变化victoriae感染。分化新lamellocytes是在解剖肺叶周边的; lamellocytes是由畸形的增强（MSNF9 GFP）驱动的GFP基因标记。使用罗丹明标记的鬼笔环肽与丝状肌动蛋白细胞可视化。请注意，前叶的完整性破坏，在这些腺体基底膜通常围绕着叶不断（ 图6C），现在是间断（ 图6D）。从相同的解剖，血淋巴lamellocytes可以也涂片中的可视化（ 图6G）;其中一些相关联的成立，以阻止寄生虫的发展（ 图6H）胶囊结构。
- 小号pätzle蛋白表达在幼虫淋巴腺（ 图7C，D）的大多数细胞。检测解剖淋巴腺SPZ，我们遵循一个标准协议，染色的淋巴腺细胞与抗-SPZ抗体4。 在体内 ，SPZ水平提高后，黄蜂感染淋巴腺细胞（比较板图。7C，电子与7G，我和面板7D，7H F，歼 ）。
- 黄蜂发展的早期和晚期阶段从寄主幼虫和蛹（ 图8）。检查蜂的发育阶段，受感染的幼虫在不同时间点解剖后产卵。在这里，我们显示了这些阶段Leptopilina菌采样。从被感染的野生型D。果蝇主持。
图1。不同蜂种和蜂卵产卵。所有图片使用徕卡立体显微镜获得一个 果蝇Trichopria女性的黄蜂oviposits到了 D蛋果蝇蛹，B Trichopria果蝇产卵放大到主机蛹，C变暗点，表明在产卵部位的伤口愈合。 赉 。 boulardi男，E G. xanthopoda女性，F L. Ğ 研究victoriae女性。 heterotoma男（左）和女性。
图2。生命周期飞/黄蜂军备竞赛。产卵结果在两个成果之一。无论是宿主的免疫反应成功阻止发展黄蜂（左），或黄蜂阻挠宿主的免疫发源于NSES和成功（右）。从梅尔克和Govind，1999年第18改性。
图3。三龄幼虫显示感兴趣的器官前清扫。所有图片使用徕卡立体显微镜获得一个 HML>绿色荧光蛋白与GFP（绿色）的幼虫淋巴腺单个细胞的荧光（箭头）表示一般的淋巴腺位置在一个完整的动物。荧光和亮场光学成像与幼虫。箭头指向乙 CG GFP绿色荧光蛋白表达在脂肪体表示的器官在一个完整的阿尼姆的位置幼虫为淋巴腺清扫描述的协议文本中的重要位置。等。箭头指向为脂肪体解剖描述的协议文本中的重要位置。
图4。免疫遗传主机电路对寄生蜂的攻击。Toll途径的核心组件的免疫反应 。被激活的蛋白酶Spätzle加工酶，SPEspätzle（SPZ）。 SPZ活性炭作为配收费。细胞内的信号，导致活化的NF-κB转录因子，背和DIF。仙人掌服务的途径IκB的抑制剂。 Drosomycin，规范收费通路靶基因激活，可以监控使用GFP报告基因的苍蝇株（见图6I的J）。
图5。在响应封装到 L victoriae为患需要蛇> GFP-DL的果蝇主机。 蛇基因增强表达在血细胞13。当这个增强驱动背GFP的融合蛋白在转基因的表达，背一些浆细胞和lamellocytes弥补胶囊和聚合通过GFP的绿色荧光检测。所有图片使用蔡司LSM的共聚焦显微镜。 研究蛋样品victoriae。 屋宇署 Lamellocytes的（白色箭头）在后端的鸡蛋表达GFP的背。 光盘放大倍率越高，在面板B. EH样品counterstained罗丹明标记的鬼笔形象化丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白，红）用Hoechst 33258可视化的DNA（蓝色），E L.封装鸡蛋victoriae 楼变暗胶囊的研究 生长激素 研究victoriae。 victoriae infection诱导血细胞聚集（plasmatocyte和lamellocyte）。
图6。免疫反应，反对黄蜂感染。面板中的图像，获得A和B使用蔡司Axio上的范围。 CJ-获得使用蔡司 共聚焦显微镜LSM的板中的图像。寄主幼虫通过透明角质层显示变暗封装蜂卵（箭头）。 乙代表第三龄幼虫淋巴腺的Hoechst 33258染色显示穿插所有的叶和心包细胞的细胞。比例尺代表100μ。CJ-counterstained所有样品均用Hoechst 33258（标签原子核）和罗丹明鬼笔环肽（F-actin的标记）。CD前淋巴结腺叶对照组（C）和L. victoriae感染（四）MSNF9-GFP的动物。在受感染的动物，MSNF增强的表现，具体到洛杉矶mellocytes 14，核GFP记者发现，从感染的动物隔离é浆细胞不表达绿色荧光蛋白。这些动物也有极少数，如果的任何lamellocytes。F浆细胞（GFP阴性，短箭头） 属弱核GFP表达与分化新的，更大的lamellocytes（长箭头） victoriae感染的MSNF9-GFP的幼虫，G和聚合浆细胞和lamellocytes从一个研究 hemocoel感染victoriae-DRS-GFP的幼虫。 DRS-GFP记者表达被激活，在一些浆细胞（短箭头），但不是在lamellocytes（长箭头）感染后，H封装和研究变暗黄蜂幼虫boulardi感染MSNF9的GFP主机幼虫的。许多MSNF9 GFP阳性lamelloctyes环绕的黄蜂幼虫（黑暗的结构;粗箭头），并表现出强大的核GFP表达（长箭头）。这锅EL以前发表在PLoS ONE 15。IJ脂肪体细胞从感染的（我）和L.解剖victoriae感染（十）DRS-GFP幼虫。 GFP是在受感染的动物脂肪体细胞的核和细胞质。 点击这里查看大图 。
图7。寄生蜂的感染。spätzle表达后欧塞尔样品counterstained的Hoechst 33258 DNA的可视化。所有使用蔡司LSM的共聚焦显微镜图像获得。从解剖未受感染的YW幼虫的自动对焦前叶。样品进行了处理，没有主要抗体的间接免疫染色（A和B）或抗的SPZ抗体（红色，C，D，E，F）和counterstained网站面粉鬼笔（绿色标签的F-肌动蛋白在细胞;B，D F）的吉焦前叶解剖感染YW幼虫和反SPZ抗体染色（红色，G，H，我十）的Alexa Fluor-鬼笔环肽（绿色;板Ĥ，歼） 外汇放大倍率越高，在C和D，分别IJ G和H样品的放大倍率较高，分别为样本。比例尺面板地下AD，H代表50微米。
图8。 L.幼虫和蛹的阶段heterotoma和L。分离幼虫或蛹飞的主机后为患boulardi。各个阶段，如所示。所有图片使用蔡司Axio上的范围。 连续自动对焦 L. heterotoma阶段，在感染后1-6天。 下方有一排自动对焦胚后L。 boulardi阶段，感染后4至12天。
图9。实验协议的流程图。
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Discussion
在对果蝇的寄生蜂的兴趣正在涌动解码整个基因组的分子生物学技术成为高效率和成本效益。然而，相对于他们非常出色的研究主机，蜂生物学的许多有趣的方面仍模糊不清。这些措施包括申办范围，免疫抑制，过寄生和行为有关的问题。这次演讲的重点是要证明在果蝇的免疫组织感染的影响。这里展示的解剖技术可以用于基因表达分析，RNA水平（ 原位杂交），或在提取核酸芯片或PCR技术，或西方的蛋白质分析。广大的飞株提供多种股票的中心和个人研究实验室操作和标记的免疫细胞。粉煤灰菌株的选择取决于实验的问题。这些解剖技术也可用于免疫分析其他果蝇组织。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢的托德Schlenke教授，教授托尼IP转基因果蝇株，为Trichopria果蝇和教授卡尔桥本反Spätzle抗体。此演示实验室的贡献，我们感谢过去和现在的成员。支持这项工作是由下列补助：（S06 GM08168，高层41399-009，和G12-RR03060），，从国立卫生研究院，美国农业部（野村综合研究所/农业部CSREES 2006-03817和2009-35302-05277）和PSC-纽约市立大学。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
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