Summary
Parasitoïde (parasite) guêpes constituent une classe importante des ennemis naturels des insectes, y compris de nombreux
Protocol
Le protocole complet pour l'expérience est divisée en quatre étapes (Fig. 9). Guêpes culture (1) sur les larves de mouches, (2) Mise en place d'infections et de préparer les animaux pour la dissection, (3) isolation et de fixation hôte / parasite structures; (4) Analyse de tissus immunitaires.
1. Guêpes culture sur larves de drosophile
Entretien des cultures de guêpes nécessite une planification minutieuse. Par rapport à la croissance des mouches, il est assez de main-d'œuvre. Nous maintenons nos colonies de guêpes dans le laboratoire sur des larves ou des pupes de la souche de Drosophila yw à 24 ° C. La culture de guêpes consiste à maintenir une source continue d'hôtes au stade de la droite et de compensation des «infectés» flacons de mouches qui émergent avant les guêpes faire. Guêpes suivre la méthode haplodiploïde de détermination du sexe et il est donc important que les femelles sont accouplées avant qu'ils n'infectent les hôtes.
- Au jour 1, ajouter une noisette de frais de pré-pâte de levure comparé (en mélangeant 1 ml d'eau à peu près 1 g de levure sèche active dans un flacon alimentaire mouche frais La recette de la nourriture volée n'est pas critique;. nous grandissons mouches sur le support corn-meal/sucrose/agar. Lieu 50-60 jeune (2-4 day-old) adulte yw (ou tout autre souche de type sauvage essentiellement) vole à pondre des œufs pendant 48 heures à 24 ° C.
- Au jour 3, supprimer les mouches des flacons. Placez un bouchon buzz sur le flacon avec une goutte de miel sur le côté intérieur de la fiche buzz. Le miel est dilué 2:1 dans de l'eau distillée.
- En utilisant le CO 2, anesthésier les guêpes et les trier 6-8 femelles et mâles 6-8 qui sont environ 2-3 jours. Ajoutez-les à la fiole contenant 0-48 heures hôtes anciennes. Notez que les guêpes sont plus sensibles au CO 2 que les mouches, et vous pourriez avoir à calibrer leur exposition au gaz. Chercheurs drosophile ne pas utiliser une conception standard Drosophila station de l'anesthésie. Un bon point de départ pour anesthésier les guêpes consiste à définir la pression de CO 2environ la moitié de ce qui est nécessaire pour les mouches d'anesthésie.
- Remettre le bouchon buzz (avec du miel) sur le flacon. Placez délicatement le flacon sur le côté jusqu'à ce que les guêpes se réveiller.
- Placez ces flacons avec des larves de mouches et de guêpes dans un incubateur à 24 ° C.
- Infections retenus seront retarder nymphose légèrement. Les hôtes qui ont subi une attaque de guêpes, mais sont capables de se défendre (ou si elles ne sont pas infectés), poursuivre le développement en suivant le calendrier normal et les mouches adultes émergent de ces pupes bien en avance sur les guêpes.
- Selon l'espèce de guêpe et de la température, les guêpes éclosent en 25-30 jours.
- Retirez les mouches adultes à partir des flacons dans lesquels les guêpes sont en voie de développement.
2. Mise en place d'infections et de préparer les animaux infectés pour la dissection
Avant de commencer, un couple de verre ou des boîtes de Pétri en plastique, un plat en pyrex de dissection avec 9 dépressions, Kimwipes, de l'eau distillée (dans une bouteille), 70% d'éthanol (dans une bouteille), du PBS 1X (dans une bouteille), des lames de microscope, et un petit, spatule propre à portée de main.
- Pour configurer les infections, suivez les étapes 1-5 ci-dessus. Selon l'expérience, il peut être nécessaire d'utiliser les hôtes qui sont à peu près au même stade de développement. Pour cela, egglays de 2-6 heures peut être utilisé pour l'infection.
- Pour récolter des larves infectées (pour les dissections de tissus immunitaires ou des parasites), supprimer le contenu des flacons de mouches dans un petit verre ou en plastique boîte de Pétri.
- L'utilisation d'un stéréomicroscope et une pince fine (pince à épiler), choisir soigneusement 6-10 larves, un par un et les placer dans une dépression bien avec du PBS 1X, puis les transférer dans l'eau, l'éthanol à 70%, l'eau et du PBS 1X, successivement. Le but de ces étapes est de libérer les animaux de la nourriture volée et nettoyer soigneusement et stériliser leur surface. Le rincer à l'eau dilue l'éthanol et le rinçage final dans du PBS élimine l'éthanol. Pour l'étape 3 ci-dessous, il est préférable de ne pas quitter leanimaux dans du PBS pour plus de 10 minutes.
3. L'isolement et de fixation hôte / parasite Ouvrages d'art
Fond
Le ganglion lymphatique larvaire est un 7 petit organe hématopoïétique. Au troisième stade larvaire, la glande lymphatique contient une grande paire de lobes antérieurs qui flanquent le vaisseau dorsal (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). Les lobes antérieurs sont divisés en régions spécialisées ayant des propriétés de cellules uniques 7. Progéniteurs de trois types de cellules, plasmatocytes lamellocytes et les cellules à cristaux résider dans les lobes antérieurs. Cellules péricardiques séparer les lobes antérieurs des petits lobes postérieurs. Le ganglion lymphatique chez la drosophile est un modèle pour l'hématopoïèse insectes et de mammifères 8,9.
De graisse corporelle est fonctionnellement identique au foie des mammifères. La réponse humorale est déclenchée dans le microbienne suivante de graisse corporelle ou 1,4,10 infection guêpe. CommeEn conséquence, une combinaison unique de gènes peptides antimicrobiens sont activés et les peptides sont sécrétés dans l'hémolymphe 1. La graisse corporelle est aussi le tissu primaire pour la production de glycogène et de triglycérides et de stockage 11. Le corps de la larve grasse occupe volume substantiel de l'hémocèle et, si différent de la glande lymphatique, il est facile à localiser. Nous allons maintenant démontrer comment disséquer la glande lymphatique et la graisse du corps d'un stade larvaire tiers.
Avant de commencer
Besoin d'une pince fine (pince à épiler) et l'éthanol nettoyés lames de microscope.
Larvaire dissection des ganglions lymphatiques
- En utilisant des pinces fines, sélectionnez une errance larve du troisième stade larvaire conservés dans du PBS 1X.
- Placez la larve sur une lame de microscope.
- En utilisant des pinces, placer l'animal avec la face ventrale vers le haut.
- L'utilisation de deux paires de pinces, tenir l'animal de chaque côté de l'extrémité postérieure (flèches 1, Fig. 3A) et gently tirez la cuticule d'introduire une petite déchirure superficielle de la cuticule.
- Le hémolymphe contenant hémocytes, l'intestin, et le corps gras commence à s'échapper de la cavité du corps. Le hémolymphe peut être pris avec un 10 ul "pipetteman" de faire des frottis, si nécessaire.
- Placer les deux pinces sur le côté droit de l'animal sous les crochets buccaux (pointes de flèche 2, Fig. 3A), délicatement arracher la cuticule.
- Déplacez les deux pinces sur le côté gauche de l'animal sous les crochets buccaux (pointes de flèche 2, Fig. 3A) et soigneusement faire une autre petite déchirure.
- Tout en maintenant la bouche des crochets de l'animal, tirez doucement sur la cuticule vers le bas vers l'extrémité postérieure de l'animal (comme si elle éplucher).
- Comme la cuticule est tiré vers l'arrière, le cerveau, le corps gras, les disques imaginaux, glandes salivaires, et le proventricule deviendra exposés. La cuticule est maintenant détaché à l'extrémité postérieure, mais auront toujours le vaisseau dorsal avec la glande lymphatique qui s'y rattachent. </ Li>
- Couper le proventricule et l'éloigner de la région de la glande lymphatique. Le ganglion lymphatique sera sous le cerveau, même si vous ne pouvez pas être en mesure de le voir.
- Soigneusement taquiner l'écart de la graisse corporelle, de l'intestin, les glandes salivaires, et d'autres structures qui peuvent être assis sur la glande. Soyez prudent de ne pas détacher la glande lymphatique de la glande anneau et le vaisseau dorsal situé postérieure du cerveau. Le ganglion lymphatique sera positionné à plat contre la lame de microscope.
- Retirez soigneusement tous les tissus supplémentaires loin de la glande lymphatique jusqu'à ce que la glande entière se déroule dans les lobes antérieurs à la dernière série de cellules péricardiques.
Remarque: Un ganglion lymphatique bien disséqué aura une paire de lobes antérieurs et deux ensembles de lobes postérieurs long du vaisseau dorsal (Fig. 6B). Les lobes peuvent être facilement endommagés ou peuvent tomber à partir du vaisseau dorsal. Les échantillons doivent donc être manipulés avec grand soin. La glande aussi hcomme une tendance à se recroqueviller ou d'un contrat. Doucement redresser l'organe à son extrémité postérieure permet à toutes les parties et les cellules doit être présenté ainsi. Cela est particulièrement nécessaire pour les protocoles immunocoloration.
La dissection du corps Fay
- Sur la scène de dissection de l'Zeiss 1000 microscope à dissection (n'importe quelle source stéréo microscope à dissection peut être utilisé), placez une zone de lumière qui permet à la lumière incidente d'être transmise à travers l'échantillon. Placez une larve du troisième stade larvaire de l'étape 2 sur une lame de microscope dans 200 ul de PBS 1X. Inclinez la source de lumière loin de l'échantillon de telle sorte que l'organisme semble transparente et donc il est facile de visualiser ses organes internes.
- En utilisant le forceps, la position de l'animal de telle sorte que l'extrémité antérieure est loin de vous.
- En utilisant le forceps, maintenez la cuticule de la larve sur le côté gauche de ses crochets buccaux (flèche 1, Fig. 3B). Utilisation de la pince d'autres, légèrement déchirer la cuticule tout le chemin à l'extrémité postérieure (arrowhead 2, figure 3B). Ne déchirez pas la cuticule du corps à l'extrémité postérieure.
- Très doucement commencer à enlever l'intestin d'un côté.
- Retirez délicatement le cerveau, les disques imaginaux, et la glande ring avec la glande lymphatique qui traverse le vaisseau dorsal.
- Ne pas enlever les glandes salivaires car il ya de graisse corporelle adhérant à ces glandes.
- Retirez délicatement la cuticule et de laisser le corps gras sur la diapositive dans du PBS 1X.
Note 1: La graisse corporelle a une seule couche de cellules et il est donc important d'avoir toutes les cellules aplaties dans le même plan sur la lame de verre. Les cellules sont endopolyploid et facile à visualiser. Un échantillon corporel bien-disséqué matières grasses devrait maintenir des contacts cellulaires normales, et devrait avoir un minimum de globules gras autour de l'échantillon (Fig. 6I disséqué, J).
Note 2: Si les œufs de guêpes ne sont pas affectées par le système immunitaire de l'hôte, ils seront initiatdéveloppement de l'e presque immédiatement. Les premières étapes du développement du parasite (de la larve hôte) sont facilement accessibles depuis l'hémocèle disséqué (fig. 8). Œufs de parasites ou de larves, soit adhérer à la graisse du corps ou d'autres organes, ou tout simplement glisser sur la lame de verre lors de la dissection.
4. Analyse tissus immunitaires
- Glandes lymphatiques Air sec pour 5-10 min et supprimer du PBS 1X à partir de la diapositive de graisse du corps avant de fixer pendant 5-10 minutes avec du paraformaldéhyde 4% préparée dans du PBS. Chaque diapositive peut avoir plusieurs ganglions lymphatiques disséqués pour la coloration. Déplacer des diapositives avec des échantillons fixes dans une chambre de maison humidifié pour des étapes ultérieures. Cette chambre est préparé en plaçant deux morceaux de pliées, serviettes en papier humides au fond d'une boîte embout en plastique micropipette vide. Un ou plusieurs lames avec des échantillons peuvent être placés sur le dessus du diviseur utilisé pour maintenir les pointes.
- En tant que tel, l'analyse des tissus immunitaires se fait suivant des méthodes standardse combinent dans l'étiquetage des cellules in vivo et 4 immunohistochimie indirecte.
5. Les résultats représentatifs
- L'infection Wasp active l'expression du journaliste voie Toll drosomycine-GFP (Fig. 6G, J). Dans cette expérience, l'effet de guêpe-infestation sur l'expression génique est visualisée in vivo utilisant un GFP-journaliste lié au promoteur Drs 12. Chez les animaux témoins non infectés, l'expression de la GFP n'est pas détecté. Le signal de la GFP est clairement détecté dans le cytoplasme et le noyau des cellules de la graisse corporelle, disséqué d'animaux infectés par L. victoriae. Pour obtenir les meilleurs résultats, le rapport de guêpes: les hôtes doivent être 1:10. L'infection devrait durer au moins 2 heures. Infestation Post, les signaux s'intensifie Drs-GFP et de nombreuses cellules de graisse du corps sont GFP-positives, même jusqu'à 72 heures 1,4.
- L'infection induit la différenciation des Wasp lamellocytes dans le lglande ymph (fig. 6D). Lamellocytes entourent et de bloquer le développement de guêpe (Fig. 6H). Les ganglions lymphatiques sont disséqués pour visualiser les changements cellulaires induits dans les lobes antérieurs après L. victoriae infection. Nouvellement différenciés lamellocytes sont présents à la périphérie des lobes disséqués; lamellocytes sont marqués d'un transgène GFP qui est entraînée par le difforme enhancer (MSNF9-GFP). Toutes les cellules sont visualisées avec l'actine filamenteuse à l'aide marqué à la rhodamine phalloïdine. Notez que l'intégrité des lobes antérieurs est perturbée dans ces glandes comme la membrane basale qui entoure normalement le lobe en continu (Fig. 6C), est maintenant discontinue (Fig. 6D). D'après les dissections mêmes, lamellocytes dans l'hémolymphe peuvent également être visualisées dans les frottis (Fig. 6G); dont certains sont associés à la structure de la capsule formée de bloquer le développement du parasite (fig. 6H).
- Sprotéines pätzle est exprimé dans la plupart des cellules de la glande lymphatique larvaire (Fig. 7C, D). Pour détecter Spz dans les glandes lymphatiques disséqués, nous avons suivi un protocole standard pour la coloration des cellules de la glande lymphatique avec des anticorps polyclonaux anti-SPZ anticorps 4. In vivo, l'augmentation des niveaux Spz dans les cellules des glandes lymphatiques après l'infection de guêpe (comparer les panneaux Fig. 7C, E avec 7G, I, et 7D panneaux, F avec 7H, J).
- Stades précoces et tardifs de développement de larves de guêpe hôte et pupes (fig. 8). Pour examiner les stades de développement de guêpes, les larves infectées sont disséqués à divers moments après la ponte. Ici, nous montrons un échantillon de ces étapes, de la Leptopilina spp. De type sauvage infecté D. melanogaster héberge.
Figure 1. Différentes espèces de guêpes et de ponte de l'œuf de guêpe. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un stéréomicroscope Leica. Une guêpe femelle pond drosophilae Trichopria œuf dans un D. melanogaster nymphe. Grossissement B de la ponte de la drosophile en Trichopria accueil taches nymphe C. mélanisées indiquent la cicatrisation des plaies sur le site de ponte. D L. boulardi masculine. E G. xanthopoda femme. F L. femme victoriae. G L. heterotoma mâle (à gauche) et femelle.
Figure 2. Les cycles de vie montrant la course à la mouche / guêpe bras. Résultats de ponte dans l'un des deux résultats. Réactions de l'hôte soit immunitaires réussir à bloquer le développement de la guêpe (à gauche), ou la guêpe contrecarre immunitaire de l'hôte RespoNSE et réussit (à droite). Mise à jour de Melk et de Govind, 1999 18.
Figure 3. Troisième stade larvaire montrant les organes d'intérêt avant la dissection. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un stéréomicroscope Leica. Une Hml> GFP larve avec la GFP (green) de fluorescence (flèche) dans des cellules individuelles de la glande lymphatique indique l'emplacement général de la glande lymphatique chez un animal intacte. La larve a été imagées avec optique en champ de fluorescence et lumineux. Pointes de flèches indiquent les endroits importants pour le protocole curage ganglionnaire glande décrite dans le texte. B Cg> GFP larve avec expression de la GFP dans le corps gras pour indiquer l'emplacement de l'orgue dans une anim intacteAl. Pointes de flèches indiquent les endroits importants pour le protocole de dissection de graisse du corps décrite dans le texte.
Figure 4. Immuno-génétique circuit de la réponse immunitaire de l'hôte contre les composants de base de parasitoïdes attaque. De la voie Toll sont présentés. Spätzle (SPZ) est activé par l'enzyme protéase de traitement Spätzle, SPE. Activated Spz sert de ligand pour Toll. Signalisation intracellulaire conduit à l'activation de facteurs de transcription NF-kB, les dorsaux et Dif. Cactus sert l'inhibiteur IkB de la voie. L'activation de la drosomycine, un gène sans canonique voie cible, peut être contrôlé en utilisant des souches de mouches transgéniques avec le rapporteur GFP (voir Fig. 6I, J).
Figure 5. Encapsulation en réponse à L. infestation victoriae dansSerpent> GFP-dl hôtes Drosophila. Un enhancer du gène Serpent est exprimée en 13 cellules sanguines. Lorsque cet enhancer entraîne l'expression de la protéine de fusion GFP-dorsale dans un transgène, dorsale est détectée via la fluorescence verte de la GFP dans certains plasmatocytes et lamellocytes qui composent les capsules et les agrégats. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM. Un oeuf de L. grossissements victoriae. lamellocytes BD (flèches blanches) à l'extrémité postérieure de l'express oeuf GFP-dorsale. CD plus élevés de l'échantillon dans le panneau B. EH échantillons sont contre-marqué à la rhodamine phalloïdine pour visualiser l'actine filamenteuse (F-actine, rouge) et avec Hoechst 33258 pour visualiser l'ADN (bleu). E encapsulé œuf de L. victoriae. F capsule mélanisée de L. victoriae. GH L. victoriae infection induit des cellules du sang (plasmatocyte et lamellocyte) l'agrégation.
Figure 6. Les réponses immunitaires contre les infections guêpe. Images dans les panneaux A et B ont été obtenues à l'aide d'une étendue Zeiss Axio. Images dans les panneaux CJ ont été obtenus en utilisant un microscope confocal Zeiss LSM. Une larve hôte montrant mélanisée oeuf de guêpe encapsulé (tête de flèche) à travers la cuticule transparente. B représentant la glande lymphatique troisième stade larvaire colorées avec Hoechst 33258 révèle des cellules de tous les lobes et entrecoupées cellules péricardiques. La barre d'échelle représente 100 μ. CJ Tous les échantillons ont été contre-colorées avec Hoechst 33258 (à noyaux étiquette) et la rhodamine phalloïdine (pour étiqueter F-actine). CD lobes antérieurs des glandes lymphatiques de contrôle (C) et L. victoriae-infectés (D) MSNF9-GFP animaux. Chez les animaux infectés, MSNF enhancer expression, spécifiques à lamellocytes 14, est détectée avec un rapporteur GFP nucléaire. plasmatocytes E isolés chez des animaux non infectés ne pas exprimer la GFP. Ces animaux ont très peu ou pas de lamellocytes. F plasmatocytes (GFP-négative, flèche courte) et nouvellement différenciés, lamellocytes grandes (flèches longues) avec expression de la GFP nucléaire faible de L. victoriae-infecté MSNF9-GFP larve. plasmatocytes G libres et agrégée et lamellocytes de la hémocèle d'un L. victoriae-infecté Drs-GFP larve. L'expression de la journaliste Drs-GFP est activée dans certains plasmatocytes (flèche courte), mais pas dans lamellocytes (flèches longues) post-infection. H encapsulé et larve de guêpe mélanisée de L. boulardi-infectés larve hôte MSNF9-GFP. De nombreux MSNF9-GFP-positives lamelloctyes entourent la larve de guêpe (structure sombre; flèche épaisse) et présentent une forte expression de la GFP nucléaire (flèches longues). Ce panel déjà publié dans la revue PLoS One 15. cellules de graisse du corps disséqué IJ de non infecté (I) et L. victoriae-infecté (J) Drs-GFP larve. GFP est nucléaire et cytoplasmique dans les cellules de graisse du corps des animaux infectés. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 7. Expression Spätzle après l'infection guêpe parasitoïde. Échantillons ont été contre-AJ avec Hoechst 33258 pour visualiser l'ADN. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope confocal Zeiss LSM. Lobes antérieurs AF disséqués à partir de larves yw non infecté. Les échantillons ont été traités pour immunocoloration indirecte sans anticorps primaire (A et B) ou avec des anti-Spz anticorps (rouge; C, D, E, F) et de contraste avec Alexa Flour-phalloïdine à l'étiquette F-actine dans les cellules (vert;. B, D, F) lobes antérieurs GJ disséqués à partir de larves yw infecté et colorées avec des anticorps anti-Spz (rouge; G, H, I, J) et Alexa Fluor-phalloïdine (vert;. Les panneaux H, J) EF forts grossissements d'échantillons dans C et D, respectivement. grossissements IJ supérieur des échantillons dans G et H, respectivement. Barres d'échelle dans la MA panneaux, G, H représentent 50 um.
Figure 8. Les stades larvaires et la nymphe de L. heterotoma et L. boulardi. Les étapes individuelles ont été isolées à partir de la mouche après infestation larvaire ou nymphal hôtes, comme indiqué. Toutes les images ont été obtenues à l'aide d'une étendue Zeiss Axio. Haut ligne AF L. stades heterotoma, 1-6 jours après l'infection. Bas de ligne AF postembryonnaire L. stades boulardi, 4 à 12 jours après l'infection.
Figure 9. Diagramme du protocole expérimental.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
L'intérêt pour les guêpes parasites de la drosophile est en pleine progression que les techniques moléculaires pour décoder les génomes entiers devenir efficace et rentable. Toutefois, par rapport à leurs exceptionnellement bien étudiés hôtes, de nombreux aspects fascinants de la biologie de guêpe restent obscures. Il s'agit notamment de questions liées à la gamme d'hôtes, la suppression immunitaire, superparasitisme, et le comportement. L'objectif de cette présentation était de démontrer les effets de l'infection sur les tissus immunitaires de la mouche. Les techniques de dissection décrites ici peuvent être utilisés pour l'analyse de l'expression des gènes au niveau de l'ARN (hybridation in situ), ou pour l'extraction d'acide nucléique pour les microarrays ou PCR, ou pour des analyses occidentales de protéines. Une grande variété de souches de mouches sont disponibles auprès des centres de stockage et les laboratoires de recherche individuels de manipuler et de marquer les cellules immunitaires. Le choix des souches de mouches est dicté par les questions expérimentales. Ces techniques de dissection peut aussi être utilisé pour l'analyse du système immunitairetissus des espèces de Drosophila autres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants au professeur Todd Schlenke pour Trichopria drosophilae, le professeur Tony Ip pour les souches de mouches transgéniques, et le professeur Carl Hashimoto anti-Spätzle anticorps. Nous tenons à remercier les membres actuels et passés du laboratoire pour leurs contributions à cette présentation. Ce travail a été soutenu par les subventions suivantes: des NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009, et G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 et 2009-35302-05277) et de la CFP-CUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
- Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
- Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234 (2010).
- Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
- Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199 (2007).
- Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
- Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429 (2009).
- Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
- Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
- Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).
