Summary
Parasitoid (parasitiska) getingar utgör en stor klass av naturliga fiender många insekter, inklusive
Abstract
Mest kända parasitoid geting arter angripa larvala eller puppa stadier av Drosophila. Medan Trichopria drosophilae infektera puppa stegen i värden (Fig. 1A-C), honor av släktet Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) och Ganaspis (Fig. 1E) angriper larvstadierna. Vi använder dessa parasiter för att studera den molekylära grunden för en biologisk kapprustning. Parasitsteklar har en enorm värde som biokontrollmedel. De flesta av dem bär virulens och andra faktorer som modifierar host fysiologi och immunitet. Analys av Drosophila getingar ger insikter i hur arter-specifika interaktioner forma genetiska strukturer av naturliga gemenskaperna. Dessa studier fungerar också som en modell för att förstå de värdens immunsystem fysiologi och hur samordnade immunreaktioner bemöts med denna klass av parasiter.
Den larver / puppa ytterhud tjänar som den första raden i defense. Getingen gadd är en skarp nål-liknande struktur som effektivt avger ägg in i värden hemocoel. Oviponering följs av en sårläkande reaktionen vid hinnan (fig. 1C, pilhuvuden). Vissa getingar kan sätta in två eller fler ägg i samma värd, även om utvecklingen av endast ett ägg lyckas. Övertaliga ägg eller utveckla larver elimineras genom en process som ännu inte är klarlagd. Dessa getingar därför kallas solitära parasitoider.
Beroende på fluga stammen och arten geting har WASP ägget en av två öden. Det är antingen inkapslad, så att dess utveckling är blockerad (host framträder,. Figur 2 vänster), eller geting ägg kläcks, utvecklar, molts och växer till en vuxen (geting framträder,. Figur 2 till höger). L. heterotoma är en av de bäst studerade arter av Drosophila parasitsteklar. Det är en "generalist", vilket innebär att den kan utnyttja de Drosophila species som värdar 1. L. heterotoma och L. victoriae är syster arter och de producerar virus-lika partiklar som aktivt interfererar med inkapsling respons 2. Till skillnad från L. heterotoma, L. boulardi är en specialiserad parasit och utbudet av Drosophila arter den använder är relativt begränsad 1. Stammar av L. boulardi producerar även virusliknande partiklar 3 även om de skiljer sig signifikant i sin förmåga att lyckas på D. melanogaster 1. Några av dessa L. boulardi stammar är svåra att växa på D melanogaster 1 som flugan värd lyckas ofta i inkapsling sina ägg. Därför är det viktigt att ha kunskap om båda parter i specifika experimentella protokoll.
Förutom barriäreffekter vävnader (nagelband, tarm och luftstrupe), Drosophila larver har systemisk cellulära och humorala immunsvar som uppstår from funktioner blodkroppar och fettet kropp, respektive. Äggläggning av L. boulardi aktiverar både immuna armar 1,4. Blodkroppar finns i omlopp, i fastsittande populationer under segmenterade nagelband samt i lymfan körteln. Den lymfkörtelområde är en liten hematopoetisk orgel på ryggsidan av larven. Kluster av hematopoietiska celler, kallade lober, är anordnade segmentellt parvis längs ryggens kärlet som löper längs den anteriora-posteriora axel hos djuret (fig 3A). Fettet kroppen är en stor multifunktionell organ (fig. 3B). Den utsöndrar antimikrobiella peptider som svar på mikrobiell och flercelliga infektioner.
Geting infektion aktiverar immunsystemet signalering (fig. 4) 4. Vid den cellulära nivån, utlöser det delning och differentiering av blodceller. I självförsvar, aggregat och kapslar utvecklas hemocoel av infekterade djur (Fig. 5) 5,6. Activeras blodkroppar migrera mot geting ägg (eller geting larv) och börja bilda en kapsel runt den (fig. 5A-F). Vissa blodceller aggregera för att bilda noduler (fig 5g-H). Noggrann analys visar att getingen infektion inducerar den främre längst lymfkörtelområde lober för att skingra på deras periferier (Fig. 6C, D).
Vi presenterar representativa data med transduktion Toll signalväg komponenter rygg-och Spätzle (fig. 4,5,7), och dess mål Drosomycin (Fig. 6), för att illustrera hur vissa förändringar i lymfan körteln och hemocoel kan studeras efter WASP infektion . Dissektion protokollen beskrivs här ger också geting ägg (eller utveckla stadier av getingar) från värden hemolymfa (Fig. 8).
Protocol
Hela protokollet för experimentet är uppdelad i fyra steg (fig. 9). (1) odling getingar på fluglarver, (2) Ställa upp infektioner och förbereda djur för dissektion, (3) isolera och fastställande värd / parasit strukturer, (4) Analysera immuna vävnader.
1. Odling Getingar på Drosophila Larver
Underhåll av geting kulturer kräver noggrann planering. I förhållande till växande flugor, är det ganska arbetskrävande. Vi upprätthåller våra geting kolonier i laboratorium på larverna eller puppor av YW stammen av Drosophila vid 24 ° C. Odling av getingar hålls en ständig källa till värdar vid rätt skede och rensa "smittad" injektionsflaskor med flugor som uppstår innan getingar gör. Getingar följer haplodiploid metoden för könsbestämning och det är därför viktigt att honorna paras innan de infektera värdar.
- På dag 1, tillsätt en liten klick färska prejämfört jäst pasta (genom att blanda 1 ml vatten i ca 1 g av aktiv torrjäst i en ny fluga livsmedel flaska Receptet på fluga mat är inte kritiskt,. vi växer flugor på corn-meal/sucrose/agar mediet. Placera 50-60 unga (2-4 dagar gamla) vuxna YW (eller någon annan i huvudsak vildtypstammen) flyger för att lägga ägg i 48 timmar vid 24 ° C.
- På dag 3, ta bort flugorna ur flaskorna. Placera en buzz kontakt på flaskan med en droppe honung på insidan av surr kontakten. Honey späds 2:1 i destillerat vatten.
- Med CO 2, bedöva getingar och sortera 6-8 honor och 6-8 hanar som är ungefär 2-3 dagar gammal. Lägga till dem i injektionsflaskan som innehåller 0-48 timmar gamla värdar. Observera att getingar är mer känsliga för CO 2 än flugor, och du kan behöva kalibrera sin exponering för gasen. Drosophila forskare inte använder en vanlig Drosophila utformning anestesi station. En bra utgångspunkt för att bedöva getingar är att CO 2 tryckettill ungefär hälften av vad som behövs för söva flugor.
- Byt surr kontakten (med honung) på flaskan. Försiktigt placera flaskan på sin sida tills getingarna vaknar.
- Placera dessa flaskor med fluglarver och getingar i ett 24 ° C inkubator.
- Framgångsrika infektioner kommer att försena pupariation något. Värdar som har drabbats av geting attack, men kan försvara sig (eller om de inte är infekterade), fortsätt utveckling efter det normala schemat och flugor vuxna fram från dessa puparia i god tid före getingar.
- Beroende på arten geting och temperatur, getingar Eclose i 25-30 dagar.
- Ta bort de vuxna flugorna från flaskorna som getingar utvecklar.
2. Ställa in Infektioner och förbereda Infekterade djur för Dissection
Innan du börjar, har ett par av rent glas eller plast rätter Petri, en Pyrex dissekerande skål med 9 depressioner, Kimwipes och destillerat vatten (i en sprutflaska), 70% etanol (i en sprutflaska), 1 X PBS (i en sprutflaska), objektglas, och en liten, ren spatel till hands.
- För att ställa in infektioner, följer du steg 1-5 ovan. Beroende på försöket, kan det vara nödvändigt att använda datorer som befinner sig på ungefär samma utvecklingsstadium. För detta kan egglays av 2-6 timmar användas för infektion.
- Att skörda infekterade larver (för dissektioner av immun vävnader eller parasiter), ta bort innehållet av flugan injektionsflaskor till ett litet glas eller plast petriskål.
- Med hjälp av en stereomikroskop och fina pincett (pincett), försiktigt plocka 6-10 larver, en efter en och placera dem i en depression brunn med 1 x PBS först, sedan överföra dem i vatten, 70% etanol, vatten och 1X PBS, successivt. Syftet med dessa steg är att befria djuren i farten mat och rengöra och sterilisera sin yta. Skölj i Vattnet späder ut etanol och den slutliga sköljningen i PBS avlägsnar etanol. För steg 3 nedan, är det bäst att inte lämnadjur i PBS under längre tid än 10 minuter.
3. Isolera och Fastställande Host / parasit strukturer
Bakgrund
Den larver lymfkörtelområde är en liten hematopoetisk orgel 7. Vid den tredje larvstadiet instar innehåller lymfkörtelområde en stor par främre loberna som flankerar den dorsala kärlet (fig. 3A, 6B-C, 7A-D). De främre loberna är vidare indelade i specialiserade områden med unika cellegenskaper 7. Stamfäder för tre celltyper, plasmatocytes och lamellocytes och celler kristall uppehålla sig i de främre loberna. Perikardiella celler skilja främre loberna från de mindre bakre loberna. Drosophila lymfkörtelområde är en modell för insekter och däggdjur hematopoes 8,9.
Fett kropp är funktionellt liknar däggdjurslever. Det humorala svaret utlöses i fett kroppen efter mikrobiellt eller geting infektion 1,4,10. SomResultatet blir att en unik kombination av antimikrobiella peptid-gener aktiveras och de peptider utsöndras i hemolymfa 1. Fettet kroppen är också den främsta vävnaden för glykogen och triglycerider produktion och lagring 11. Det larver fettet kroppen upptar stor volym hemocoel och så till skillnad från lymfkörtelområde, är det lätt att hitta. Vi kommer nu att visa hur man dissekera lymfkörtelområde och fettet kroppen från tredje stadiet larver.
Innan du börjar
Behöver fin pincett (pincett) och etanol-rengjorda objektglas.
Larver lymfkörtelområde dissektion
- Med fin pincett, välj en vandrande tredje stadiet larv hålls i 1X PBS.
- Placera larven på ett objektglas.
- Använd pincett, placera djuret med den ventrala sidan uppåt.
- Användning av två par av tången, hålla djuret vid vardera sidan av den bakre änden (pilhuvuden 1, fig. 3A) och gently dra nagelband att införa en liten, ytlig reva i nagelbanden.
- Den hemolymfa innehåller hemocyter, tarm, och fett kropp kommer att börja fly från kroppen hålighet. Den hemolymfa kan tas upp med en 10 | il "pipetteman" för att göra utstryk, om så erfordras.
- Placera båda tång på höger sida av djuret under munnen krokarna (pilspetsar 2, figur. 3A) försiktigt riva nagelbanden.
- Flytta båda pincett till den vänstra sidan av djuret under munnen hakarna (pilhuvuden 2, fig. 3A) och noggrant göra en annan liten reva.
- Håll munnen hakar på djuret genom att försiktigt dra nagelbanden ner mot den bakre änden av djur (som om peeling tillbaka).
- När nagelbanden dras tillbaka, kommer hjärnan, fett kropp, imaginal skivor, spottkörtlar och körtelmage bli exponerade. Den fristående nagelband är nu vid den bakre änden, men kommer fortfarande att ha dorsala kärlet med lymfkörtelområde fäst vid den. </ Li>
- Skär körtelmage och flytta den bort från lymfkörtelområde området. Den lymfkörtelområde blir under hjärnan även om du inte kan se den.
- Försiktigt retas bort fettet kroppen, tarm, spottkörtlar och andra strukturer som kan sitta på körteln. Var noga med att inte lossa lymfkörtelområde från ringen körteln och den dorsala fartyget ligger posteriort till hjärnan. Den lymfkörtelområde kommer att placeras platt mot mikroskopets objektglas.
- Ta försiktigt bort alla extra vävnader från lymfkörtelområde tills hela körteln utvecklas från främre loberna till den slutliga uppsättningen perikardiala celler.
Obs: En rätt dissekerat lymfkörtelområde har ett par främre lober och två uppsättningar av bakre lober längs ryggens kärlet (Fig. 6B). Loberna kan lätt skadas eller kan falla av från den dorsala kärlet. Proverna bör därför hanteras med stor försiktighet. Genomföringen också hsom en tendens att krympa eller avtal. Försiktigt räta ut orgel vid dess bakre ände tillåter alla delar och celler som skall presenteras väl. Detta är särskilt nödvändigt för immunfärgning protokollen.
Fay kropp dissektion
- På dissekerande steget av Zeiss 1000 dissektionsmikroskop (en stereo dissektionsmikroskop kan användas), placera en ljuslåda som tillåter infallande ljus att transmitteras genom provet. Positionera en tredje stadiet larv från Steg 2 på ett objektglas i 200 | il 1 X PBS. Luta ljuskällan bort från provet så att organismen visas öppet och därför är det enkelt att visualisera de inre organen.
- Använd pincett, placera djuret, så att den främre änden är borta från dig.
- Använd pincett, hålla nagelband av larven på vänster sida av munnen hakar (pilspets 1, Fig. 3B). Användning av de andra tången försiktigt sönder hinnan hela vägen till den bakre änden (arrowhead 2, Fig. 3B). Rusar inte fram ytterhud bort från kroppen vid den bakre änden.
- Mycket försiktigt börja ta bort tarmen åt sidan.
- Ta försiktigt bort hjärnan, imaginal skivor och ringen körteln med lymfkörtelområde löper genom ryggens fartyget.
- Ta inte bort spottkörtlarna eftersom det är fett kroppen ansluter sig till dessa körtlar.
- Ta försiktigt bort nagelbanden och låt fettet kroppen på bilden i 1X PBS.
Not 1: fett kroppen har endast en cellskiktet och det är därför viktigt att alla celler utplattade i samma plan på objektglaset. Celler är endopolyploid och lätt att visualisera. En väl dissekerade fett kroppen Provet bör upprätthålla normala celler kontakter, och bör ha minimala fettkulor runt dissekerade provet (Fig. 6I, J).
Not 2: Om geting ägg påverkas av värdens immunsystem, kommer de att initieratse utveckling nästan omedelbart. Tidiga utvecklingsstadier av parasiten (från värden larv) är lätt tillgängliga från dissekerade hemocoel (fig 8). Parasit ägg eller larver fäster antingen fett kroppen eller andra organ, eller helt enkelt glida på glasskiva under dissektionen.
4. Analys Immune Vävnader
- Lufttorka lymfkörtlar i 5-10 minuter och ta bort 1X PBS från fett kroppen bilden innan det fastställs i 5-10 minuter med 4% paraformaldehyd upprättats i PBS. Varje diabild kan ha flera dissekerade lymfkörtlar för färgning. Flytta bilder med de fasta prov till en hemlagad fuktkammare för efterföljande steg. Denna kammare framställs genom att placera två bitar av vikta, fuktiga pappershanddukar på botten av en tom plast mikropipett spetsen box. En eller flera bilder med prover kan placeras på toppen av den avdelande används för att hålla spetsarna.
- Som sådan är analysen av de immun vävnaderna göras efter standardmetoder somkombinerar in vivo cellmärkning och indirekt immunohistokemi 4.
5. Representativa resultat
- Geting infektion aktiverar uttryck av Toll reaktionsvägen reportern Drosomycin-GFP (fig. 6G, J). I detta experiment, är effekten av geting-angrepp på genuttryck åskådliggöras in vivo med användning av en GFP-rapportörgen kopplad till Dr promotorn 12. I oinfekterade djur i kontrollgruppen, är den GFP-uttryck detekterades inte. GFP-signalen är tydligt detekteras i cytoplasman och kärnan av cellerna i fettet kroppen, dissekerades från djur infekterade med L. victoriae. För att uppnå bästa resultat, förhållandet mellan getingar: värdarna ska 1:10. Infektionen bör pågå under minst 2 timmar. Post angrepp, DRS-GFP signal intensifieras och många fettceller kroppen är GFP-positiva ända upp till 72 timmar 1,4.
- Geting infektion inducerar differentiering av lamellocytes i lymph körtel (fig. 6D). Lamellocytes surround och blockera geting utveckling (Fig. 6H). Lymfkörtlar dissekeras för att visualisera de cellulära förändringar som induceras i främre loberna efter L. victoriae infektion. Nyligen differentierade lamellocytes är närvarande vid periferin av de dissekerade lober; lamellocytes är markerade med en GFP-transgen som drivs av den deformerade förstärkare (MSNF9-GFP). Alla celler är visualiseras med fintrådiga aktin med rhodamin-märkt falloidin. Lägg märke till att integriteten hos de främre loberna störs i dessa körtlar som basalmembranet som normalt omger loben kontinuerligt (fig. 6C), är nu diskontinuerlig (fig. 6D). Från samma dissektioner kan lamellocytes i hemolymfa också vara visualiseras i utstryk (fig. 6G); av vilka några är associerade med kapseln struktur bildad för att blockera parasitutveckling (fig. 6H).
- Spätzle proteinet uttrycks i de flesta celler i larver lymfkörtelområde (fig. 7C, D). För att detektera SPZ i dissekerade lymfkörtlar, följde vi ett standardprotokoll för färgning celler i lymfan genomföring med polyklonala anti-SPZ antikroppar 4. In vivo, SPZ nivåerna ökar i celler lymfkörtelområde efter WASP infektion (jämför paneler figur. 7C, E med 7G, I, och paneler 7D, F med 7H, J).
- Tidiga och sena stadier av WASP utveckling från host larver och puppor (Fig. 8). För att undersöka utvecklingsstadier av getingar är infekterade larver dissekeras vid olika tidpunkter efter äggläggning. Här visar vi ett urval av dessa stadier från Leptopilina SPP. Från smittade vilda typ D. melanogaster värdar.
Figur 1. Olika geting arter och oviponering av geting ägg Alla bilder erhölls med användning av en Leica stereomikroskop. En Trichopria drosophilae kvinnlig geting oviposits ägg i en D. melanogaster puppa. B Förstoring av äggläggning av Trichopria drosophilae i värdceller puppa. C Melanized fläckarna indikerar sårläkning vid stället för oviponering. D L. boulardi hane. E G. xanthopoda kvinnor. F L. victoriae hona. G L. heterotoma hane (till vänster) och kvinnor.
Figur 2. Livscykler visar fluga / getingen kapprustning. Äggläggning resulterar i en av två resultat. Antingen värdceller immunreaktioner lyckas att blockera utvecklingen av geting (vänster) eller geting överlistar värdens immunsystem responses och lyckas (höger). Ändras från Melk och Govind, 1999 18.
Figur 3. Tredje stadiets larver visar organ av intresse före dissektion. Alla bilder erhölls med hjälp av en Leica stereomikroskop. En Hml> GFP larven med GFP (grön) fluorescens (pil) i enskilda celler i lymfkörtelområde anger allmänna läge lymfkörtelområde i ett intakt djur. Larven avbildades med fluorescens och ljusa fält optik. Pilspetsar pekar till platser som är viktiga för lymfkörtelområde dissektion protokoll som beskrivs i texten. B Cg> GFP larven med GFP uttryck i fettet kroppen att ange platsen för orgeln i en intakt Animal. Pilspetsar pekar till platser som är viktiga för fett kroppen dissektion protokoll som beskrivs i texten.
Figur 4. Immuno-genetiska kretsen i värdens immunsvar mot parasitoid angrepp. Centrala komponenterna i Toll reaktionsvägen är visade. Spätzle (SPZ) aktiveras av proteaset Spätzle bearbetande enzym, SPE. Aktiverade SPZ tjänar som ligand för Toll. Intracellulär signalering leder till aktivering av NF-kB transkriptionsfaktorer, dorsala och Dif. Kaktusen tjänar som iKB inhibitor av reaktionsvägen. Aktivering av Drosomycin, en kanonisk Toll reaktionsväg målgen, kan övervakas med hjälp av transgena fly-stammar med GFP rapportörgen (se Fig. 6I, J).
Figur 5. Inkapsling som svar på L. victoriae angrepp iOrm> GFP-DL Drosophila värdar. En förstärkare i ormen genen uttrycks i blodceller 13. När denna förstärkare driver uttrycket av GFP-Dorsal fusionsprotein i en transgen, är Dorsal detekteras via den gröna fluorescens av GFP i vissa plasmatocytes och lamellocytes som utgör de kapslar och aggregat. Alla bilder erhölls med användning av en Zeiss LSM konfokalt mikroskop. En Ägg av L. victoriae. BD Lamellocytes (vita pilar) i den bakre änden av ägget uttryckliga GFP-Dorsal. CD Högre förstoringar av provet i panelen B. EH Prover motfärgas med rodamin-märkt falloidin för att visualisera fintrådiga aktin (F-aktin, röd) och med Hoechst 33258 för att visualisera DNA (blå). E Encapsulated ägg av L. victoriae. F Melanized kapsel av L. victoriae. GH L. victoriae infeInsatser inducerar blodkroppar (plasmatocyte och lamellocyte) aggregering.
Figur 6. Immunsvar mot infektion geting. Bilder i panelerna A och B erhölls med användning av en Zeiss Axio omfattning. Bilderna i paneler CJ erhölls med hjälp av en Zeiss LSM konfokalmikroskop. En mängd larver som visar melanized inkapslade WASP ägg (pilspets) genom den genomskinliga hinnan. B representant tredje stadiet larver lymfkörtelområde färgas med Hoechst 33258 avslöjar celler av alla lober och insprängda perikardiala celler. Skalstrecket betecknar 100 μ. CJ Alla prover motfärgades med Hoechst 33258 (till etiketten kärnor) och rodamin falloidin (för att märka F-aktin). CD Anterior lymfkörtelområde lober från kontroll (C) och L. victoriae-infekterade (D) MSNF9-GFP djur. I infekterade djur, MSNF förstärkare uttryck, som är specifika för lamellocytes 14, detekteras med en nukleär GFP rapportörgen. E Plasmatocytes isolerats från icke-infekterade djur inte uttrycker GFP. Dessa djur har mycket få om ens några lamellocytes. F Plasmatocytes (GFP-negativa, kort pil) och nyligen differentierade, större lamellocytes (långa pilar) med svaga kärnkraften GFP uttryck från L. victoriae-infekterade MSNF9-GFP larv. G gratis och aggregerade plasmatocytes och lamellocytes från hemocoel en L. victoriae-infekterad Drs-GFP larv. Expression av doktorerna-GFP rapportörgen aktiveras i vissa plasmatocytes (kort pil) men inte i lamellocytes (långa pilar) efter infektion. H inkapslas och melanized geting larv från L. boulardi-infekterade MSNF9-GFP värd larv. Åtskilliga MSNF9-GFP-positiva lamelloctyes omger WASP larven (mörk struktur, tjock pil) och uppvisar starka kärnkraften GFP-uttryck (långa pilar). Denna pannael tidigare publicerade i PLoS One 15. IJ Fat kroppens celler dissekeras från oinfekterade (I) och L. victoriae-infekterade (J) Drs-GFP larv. GFP är nukleär och cytoplasmisk i fett kroppens celler från infekterade djur. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 7. Spätzle expression efter parasitoid geting infektion. AJ Prover motfärgades med Hoechst 33258 för att visualisera DNA. Alla bilder erhölls med användning av en Zeiss LSM konfokalt mikroskop. AF Anterior lober dissekerade från oinfekterade yw larver. Proverna bearbetades för indirekt immunofärgning utan primär antikropp (A och B) eller med anti-SPZ-antikropp (röd, C, D, E, F) och motfärgades med Alexa Mjöl-falloidin till etiketten F-aktin i cellerna (grön;. B, D, F) GJ Främre loberna dissekerade från infekterade YW larver och färgades med anti-SPZ-antikropp (röd, G, H, I, J) och Alexa Fluor-falloidin (grön,. Paneler H, J) EF Högre förstoring av prover i C och D, respektive. IJ Högre förstoring av proverna i G och H, respektive. Skalstrecken i paneler AD, G, H representerar 50 pm.
Figur 8. Larv-och puppa stadier av L. heterotoma och L. boulardi Enskilda steg isolerades från larver eller puppa fluga värdar efter angrepp, såsom anges. Alla bilder erhölls med hjälp av en Zeiss Axio Scope. Övre raden AF L. heterotoma stadier, 1-6 dagar efter infektion. Nedre raden AF Postembryonic L. boulardi faser 4 till 12 dagar efter infektion.
Figur 9. Flödesschema av det experimentella protokollet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intresset för parasitsteklar av Drosophila är stigande som molekylära tekniker för att avkoda hela genom att bli effektiva och kostnadseffektiva. Men i förhållande till deras exceptionellt väl studerade värdar, många fascinerande aspekter av WASP biologin fortfarande oklara. Dessa inkluderar frågor som rör värdspektrum, immunsystemet, superparasitism och beteende. Fokus för denna presentation var att visa effekterna av infektion i farten immunförsvar vävnader. Dissektionen tekniker visat här kan användas för analys av genuttryck på RNA-nivå (in situ-hybridisering), eller för extraktion av nukleinsyra för mikromatriser eller PCR, eller för Western-analyser av proteiner. En stor mängd fly stammar finns tillgängliga från lager centra och enskilda forskningslaboratorier att manipulera och märka immunceller. Valet av fly-stammar dikteras av de experimentella frågor. Dessa dissekering tekniker kan också användas för analys av immunförsvaretvävnader hos andra Drosophila arter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för professor Todd Schlenke för Trichopria drosophilae, professor Tony Ip för transgena flyga stammar och professor Carl Hashimoto för anti-Spätzle antikroppar. Vi tackar nuvarande och tidigare medlemmar av lab för deras bidrag till denna presentation. Detta arbete stöds av följande stöd: från NIH (S06 GM08168, RISE 41.399-009 och G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03.817 och 2009-35302-05277) och PSC-CUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
- Schlenke, T. A., Morales, J., Govind, S., Clark, A. G. Contrasting infection strategies in generalist and specialist wasp parasitoids of Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, 1486-1501 (2007).
- Chiu, H., Morales, J., Govind, S. Identification and immuno-electron microscopy localization of p40, a protein component of immunosuppressive virus-like particles from Leptopilina heterotoma, a virulent parasitoid wasp of Drosophila. J. Gen. Virol. 87, 461-470 (2006).
- Gueguen, G., Rajwani, R., Paddibhatla, I., Morales, J., Govind, S. VLPs of Leptopilina boulardi share biogenesis and overall stellate morphology with VLPs of the heterotoma clade. Virus Res. 160, 159-165 (2011).
- Paddibhatla, I., Lee, M. J., Kalamarz, M. E., Ferrarese, R., Govind, S. Role for sumoylation in systemic inflammation and immune homeostasis in Drosophila larvae. PLoS Pathog. 6, e1001234 (2010).
- Sorrentino, R. P., Carton, Y., Govind, S. Cellular immune response to parasite infection in the Drosophila lymph gland is developmentally regulated. Dev. Biol. , 243-265 (2002).
- Sorrentino, R. P., Melk, J. P., Govind, S. Genetic analysis of contributions of dorsal group and JAK-Stat92E pathway genes to larval hemocyte concentration and the egg encapsulation response in Drosophila. Genetics. 166, 1343-1356 (2004).
- Jung, S. H., Evans, C. J., Uemura, C., Banerjee, U. The Drosophila lymph gland as a developmental model of hematopoiesis. Development. 132, 2521-2533 (2005).
- Krzemien, J., Crozatier, M., Vincent, A. Ontogeny of the Drosophila larval hematopoietic organ, hemocyte homeostasis and the dedicated cellular immune response to parasitism. Int. J. Dev. Biol. 54, 1117-1125 (2010).
- Martinez-Agosto, J. A., Mikkola, H. K., Hartenstein, V., Banerjee, U. The hematopoietic stem cell and its niche: a comparative view. Genes Dev. 21, 3044-3060 (2007).
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu. Rev. Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Schlegel, A., Stainier, D. Y. Lessons from "lower" organisms: what worms, flies, and zebrafish can teach us about human energy metabolism. PLoS Genet. 3, e199 (2007).
- Ferrandon, D., Jung, A. C., Criqui, M., Lemaitre, B., Uttenweiler-Joseph, S., Michaut, L., Reichhart, J., Hoffmann, J. A. A drosomycin-GFP reporter transgene reveals a local immune response in Drosophila that is not dependent on the Toll pathway. EMBO J. 17, 1217-1227 (1998).
- Bruckner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C. M., Rorth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev. Cell. 7, 73-84 (2004).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila. Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Tokusumi, T., Sorrentino, R. P., Russell, M., Ferrarese, R., Govind, S., Schulz, R. A. Characterization of a lamellocyte transcriptional enhancer located within the misshapen gene of Drosophila melanogaster. PLoS One. 4, e6429 (2009).
- Morales, J., Chiu, H., Oo, T., Plaza, R., Hoskins, S., Govind, S. Biogenesis, structure, and immune-suppressive effects of virus-like particles of a Drosophila parasitoid, Leptopilina victoriae. J. Insect Physiol. 51, 181-195 (2005).
- Bettencourt, R., Asha, H., Dearolf, C., Ip, Y. T. Hemolymph-dependent and -independent responses in Drosophila immune tissue. J. Cell Biochem. 92, 849-863 (2004).
- Melk, J. P., Govind, S. Developmental analysis of Ganaspis xanthopoda, a larval parasitoid of Drosophila melanogaster. J. Exp. Biol. 202, 1885-1896 (1999).
