Summary
寄生蜂（寄生）ハチを含む多くの昆虫の天敵の主要なクラスを構成する
Protocol
実験のためのプロトコル全体は、4つのステップ（ 図9）に分割されています。ハエの幼虫（1）の培養ハチ（2）感染の設定と解剖のために動物を調製する工程;（3）ホスト/パラサイトの構造を分離し、固定（4）免疫組織を分析する。
1。 ショウジョウバエの幼虫の培養スズメバチ
スズメバチの文化の維持は、慎重な計画が必要です。成長してハエに比べて、それはかなり労働集約的である。私たちは24℃でショウジョウバエのYW株の幼虫や蛹の実験室で私たちのハチのコロニーを維持する培養ハチは、右の段階でホストの連続的なソースを維持し、ハチを行う前に出てくるハエの "感染"バイアルをクリアすることが含まれます。ハチの性決定の半数性単為生殖の方法に従うと、それは彼らがホストに感染する前に、雌交配されていることが重要である。
- 1日目に、新たに事前の小さなDABを追加するpared酵母ペースト（フレッシュフライ食品のバイアルにアクティブドライイーストの約1グラムの水の1 mlを混合したフライ食品のレシピが重要ではありません。我々はcorn-meal/sucrose/agar培地上でハエを育てています。場所50から60までの若い（2-4日齢）大人YW（または他の本質的に野生型株）は24℃で48時間の卵を産むために飛ぶ
- 3日目に、バイアルからハエを削除します。バズプラグの内側の蜂蜜のドロップでバイアルにバズプラグを配置します。蜂蜜、蒸留水で2:1に希釈されています。
- CO 2を使用して 、ハチを麻酔し、6から8人の女性と約2〜3日古い6月8日、男性をソートします。 0から48時間古いホストを含むバイアルに追加します。ハチはハエよりもCO 2に敏感である、あなたはガスへの曝露を校正しなければならないことに注意してください。 ショウジョウバエの研究者は標準的なショウジョウバエの麻酔局の設計を使用しないでください。スズメバチを麻酔するのは良い出発点は、CO 2圧力を設定することです。麻酔ハエのために必要とされるものの約半分に。
- バイアルにバズプラグ（蜂蜜）を交換します。ハチが目を覚ますまでそっとその側にバイアルを配置します。
- 24℃インキュベーター内でハエの幼虫やハチでこれらのバイアルを置きます。
- 成功した感染症は少しpupariationを遅らせます。スズメバチの攻撃を受けたが、（またはそれらが感染していない場合）自分自身を守ることができていることをホストは、通常のスケジュールと大人のハエも前にハチのこれらのpupariumの複数形から出てくる以下の開発を続行します。
- 25-30日にスズメバチの種、温度、ハチ孵化するに応じて。
- ハチが開発されたバイアルから大人のハエを削除します。
2。感染を設定し、解剖のために感染した動物を準備する
開始する前に、清浄なガラスまたはプラスチック製のペトリ皿のカップル、9くぼみ、キムワイプ、蒸留水（噴霧ボトル）を持つパイレックス解剖皿を持っている、70％エタノール（噴出ボトルの中）、1X PBS（噴出ボトル）で、顕微鏡スライド、便利な小さな、きれいなへら。
- 感染を設定するには、上記1から5の手順に従います。実験に応じて、開発のほぼ同じ段階にあるホストを使用する必要があるかもしれません。このためには、2〜6時間のegglaysは、感染症に使用することができます。
- 感染した幼虫（免疫組織や寄生虫の解剖のために）収穫するには、小さなガラスまたはプラスチック製のペトリ皿にハエのバイアルの内容を削除します。
- 慎重に6月10日幼虫、一つずつを選んで、1X PBS第一とよくうつ病にそれらを配置し、実体顕微鏡、微細鉗子（ピンセット）を使用して、次に水にそれらを転送し、70％エタノール、水、1X PBS、連続して。これらの手順の目的は、フライ食品の動物を解放し、徹底的にその表面をきれいにし、滅菌することである。水ですすぎ、エタノールとPBSですすぎ、最終的にはエタノールを除去し希釈。下記のステップ3のために、それは残すことが最善ではありません10分以上、PBS中の動物。
3。ホスト/パラサイトの構造を分離し、固定
背景
幼虫のリンパ腺は、小さな造血器官7です。第三幼虫の齢で、リンパ腺は、その側面背脈管（ 図3A、6B-C、7A-D）前方のローブの大ペアが含まれています。前葉は、さらに固有のセルプロパティを7に特殊な領域に分割されています。 3種類の細胞、プラズマ細胞、lamellocytes、結晶細胞の前駆細胞は、前葉に存在します。心膜細胞が小さく後葉から前葉を分離します。 ショウジョウバエのリンパ腺は、昆虫と哺乳類の造血8,9のモデルである。
脂肪体は、哺乳動物の肝臓機能的に似ています。体液性応答は、体脂肪、次の微生物またはハチ感染1,4,10でトリガされます。としてその結果、抗菌ペプチド遺伝子のユニークな組み合わせが活性化され、ペプチドは体液1に分泌される。体脂肪はまた、グリコーゲンやトリグリセリドの生産と貯蔵11の主要な組織である。幼虫の脂肪体は血体腔の実質的な体積を占有しますので、リンパ腺とは違って、それは見つけることは容易である。我々は今、3齢幼虫からリンパ腺と体脂肪を分析する方法について説明します。
始める前に
微細な鉗子（ピンセット）とエタノール洗浄顕微鏡スライドを必要としています。
幼虫のリンパ腺郭清
- 細かい鉗子を使用して、1X PBSで保持放浪3齢幼虫を選択します。
- 顕微鏡スライド上に幼虫を置きます。
- 鉗子を用いて、腹側で動物を配置します。
- 二組のピンセットのを使用して、いずれかの後端側（矢印1、 図3A）およびgで動物を保持するentlyキューティクルの小、表面的な涙を導入するキューティクルを引き出します。
- 血球、腸、脂肪体を含む体液は、体腔からの脱出を開始します。必要に応じて体液は、塗抹標本を作るために10μlの "pipetteman"とまで撮影することができます。
- 口のフックの下に動物（矢印2、 図3A）の右側に両方ピンセットを置いて、そっとキューティクルを引き裂く。
- 口のフック（矢印2、 図3A）の下に動物の左側に、両方の鉗子を移動し、慎重に別の小さな涙を行います。
- 口を保持していると、動物のフックながら、静かに動物の後端（裏面に剥離かのように）に向かってキューティクルをプルダウンします。
- キューティクルが引き戻されたように、脳、体脂肪、成虫、唾液腺、および胃のは、露出になります。デタッチされたキューティクルは、後端になりましたが、それでもそれに接続されているリンパ腺の背脈管があります。</ LI>
- 胃のをカットし、リンパ節腺領域から、それを離れて移動します。リンパ腺は、あなたがそれを見ることができない場合でも、脳の下になります。
- 慎重に体脂肪、腸、唾液腺、および腺の上に座ってすることができる他の構造体を離れていじめる。リング腺や脳の後方に位置する背脈管からのリンパ腺をデタッチしないように注意してください。リンパ腺は、顕微鏡スライドに対してフラットに配置されます。
- 全体の腺は前部葉から心膜細胞の最終的なセットに展開するまで、慎重にリンパ腺からすべての追加の組織を削除します。
注：正しく解剖リンパ腺が背脈管（ 図6B）に沿って前方のローブの1ペアと後葉の2つのセットがあります。葉は簡単に破損することができますまたは背脈管から落ちることができます。サンプルは、したがって、細心の注意を払って処理する必要があります。また、腺Hしなびるまたは契約の傾向として。静かに、その後端に臓器を矯正すると、すべての部品、細胞が十分に提示することを可能にします。これは、免疫染色のプロトコルのために特に必要がある。
フェイボディ解剖
- ツァイス1000年解剖顕微鏡（任意のステレオ実体顕微鏡を使用することができる）の解剖ステージでは、入射光が試料を透過することができるライトボックスを配置します。 1X PBSを200μlの顕微鏡スライド上にステップ2から3齢幼虫を置きます。生物が透明で表示され、したがって、その臓器を可視化するのは簡単になるようにサンプルから光源を傾けてください。
- 鉗子を用いて、前端があなたから離れてあるように動物を配置します。
- 鉗子を用いて、その口のフックの左側（矢印1、 図3B）の幼虫のクチクラを保持します。優しく後端（ARのすべての方法キューティクルを引き裂く、他の鉗子を用いてrowhead 2、 図3B）。後端に体から離れてキューティクルを引き裂くしないでください。
- 非常に穏やかに片側に腸を除去開始します。
- そっと背脈管を介して実行リンパ腺と脳、成虫、リング腺を削除します。
- これらの腺に付着した体脂肪があるので唾液腺を削除しないでください。
- 優しくキューティクルを削除し、1X PBSでスライド上に体脂肪を残す。
注1：体脂肪が1つだけの細胞層があり、それはすべての細胞がスライドガラス上の同一平面上に平坦化されていることが重要である。細胞はendopolyploid可視化するのは簡単です。よく解剖体脂肪のサンプルでは、正常細胞の接触を維持する必要があり、解剖したサンプル（ 図6I、J）の周囲に最小限の脂肪球を持つ必要があります。
注2：スズメバチの卵は宿主の免疫系による影響を受けません残っている場合、彼らはinitiatます。ほとんどすぐにeの開発。寄生虫（ホスト幼虫から）の初期の発達段階は解剖血体腔（ 図8）から簡単にアクセスできます。寄生虫の卵や幼虫はどちら体脂肪や他の臓器に付着し、あるいは単に解剖中にスライドガラスの上にスリップ。
4。免疫組織を分析する
- 5〜10分間空気乾燥したリンパ腺とPBS中で調製し4％パラホルムアルデヒドで5-10分間固定する前に、体脂肪のスライドから1X PBSを削除します。各スライドは、染色するためのいくつかの解剖リンパ腺を持つことができます。後続のステップのために手作りの加湿チャンバー内に固定サンプルでスライドを移動します。このチャンバーは空のプラスチック製のマイクロピペットチップボックスの下部に折り畳まれ、湿らせたペーパータオルを二枚配置することにより調製される。サンプルは1つまたは複数のスライドがヒントを保持するために使用する分周器の上に配置することができます。
- このように、免疫組織の分析は、標準的な方法に従って行われることin vivo細胞標識および間接的な免疫組織化学4 に結合します。
5。代表的な結果
- スズメバチの感染は、Toll経路レポーターDrosomycin-GFPの発現（ 図6G、J）をアクティブにします。この実験では、遺伝子発現に及ぼすスズメバチ-侵入の影響は、DRSのプロモーター12にリンクされたGFPレポーターを用いたin vivo で可視化される。感染していない対照動物では、GFPの発現は検出されません。 GFPシグナルがはっきりとL.に感染した動物から切除し、体脂肪の細胞の細胞質と核内に検出されたvictoriae。最良の結果を得るためには、ハチの比率：ホストは1:10である必要があります。感染が少なくとも2時間持続する必要があります。ポスト侵入は、DRS-GFPシグナル激化、多くの脂肪体細胞でも72時間までの1,4にGFP-陽性である。
- スズメバチの感染は、lにlamellocytesの分化を誘導するymph腺（ 図6D）。 Lamellocytesサラウンドとブロックスズメバチの開発（ 図6H）。リンパ腺は、L.後の前葉に誘導される細胞の変化を視覚化するために解剖されているvictoriae感染 。新たに分化lamellocytesは解剖葉の周囲に存在する。lamellocytesは不格好なエンハンサー（MSNF9-GFP）によって駆動されるGFPの遺伝子が付いています。すべてのセルは、ローダミン標識ファロイジンを用いた繊維状アクチン可視化である。 、前葉の整合性は、通常、（ 図6C）連続して葉を囲む基底膜としてこれらの腺で破壊されていることに注意してください（ 図6D）が不連続である。同じ解剖から、体液中のlamellocytesまた、スメア（ 図6G）で可視化することができ、そのうちのいくつかは、寄生虫の開発（ 図6H）をブロックするように形成されたカプセル構造に関連付けられています。
- Spätzleタンパク質は、幼虫のリンパ腺（7C図、D）のほとんどの細胞で発現されています。解剖リンパ腺にSPZを検出するために、我々は、ポリクローナル抗SPZ抗体を4でリンパ腺の細胞を染色するための標準プロトコルに従った。in vivoでは 、スズメバチの感染後のリンパ腺細胞のSPZのレベルの増加が（パネル図を比較します。7C、E 7Gと、私は、パネル7D、7H、JとF）。
- ホストの幼虫と蛹（ 図8）からスズメバチの開発の初期と後期。ハチの発育段階を調べるために、感染した幼虫は、産卵後の種々の時点で解剖されています。ここでは、Leptopilina属から、これらの段階のサンプリングを示しています。感染した野生型からのD.ショウジョウバエでは、ホストしています。
図1。異なったスズメバチ種とスズメバチの卵の産卵。全ての画像は、ライカの実体顕微鏡を用いて得られた。Trichopria drosophilae女性スズメバチは Dに卵をovipositsホスト蛹。Cメラニンの観光スポットにTrichopria drosophilaeの産卵のショウジョウバエ蛹。Bの倍率は産卵部位での創傷治癒を示しています。D L.はboulardi男性。E G. xanthopoda女性。F L. victoriae女性。G L. heterotomaオス（左）とメス。
図2。ハエ/ハチの軍拡競争を示すライフサイクル。2つの結果のいずれかで産卵の結果。どちらの宿主の免疫反応は、スズメバチの開発（左）をブロックすることに成功したか、ハチは宿主の免疫respoを阻止NSEを（右）が成功した。メルクとゴービンド、1999 18日から変更されます。
図3。前の解剖に興味のある臓器を示す。全ての画像は、ライカの実体顕微鏡を用いて得られた。リンパ腺の個々の細胞でGFP（緑色）蛍光（矢印）とHML> GFPの幼虫がリンパ腺の一般的な位置を示す3齢幼虫無傷の動物インチ幼虫は、蛍光と明視野光学系で撮像された。矢印は、テキストで説明されてリンパ腺郭清プロトコルのための重要な位置を指しています。無傷のAnimの臓器の位置を示すために、脂肪体におけるGFPの発現とB のCg> GFPの幼虫アル。矢印は、テキストで説明されて脂肪体解剖プロトコルのための重要な位置を指しています。
図4。トール経路の寄生蜂の攻撃。コアコンポーネントに対する宿主免疫応答の免疫遺伝回路が示されています。 Spätzle（SPZ）は、プロテアーゼSpätzle処理酵素、SPEによって活性化される。活性化SPZはTollのリガンドとして機能します。細胞内シグナル伝達には、背側およびDIF NF-κB転写因子の活性化につながる。サボテンは、経路のIκB阻害剤としての役割を果たします。 Drosomycin、標準的なダイヤル経路の標的遺伝子の活性化は、（ 図を参照してください。6I、J）GFPレポータートランスジェニックハエ系統を使用して監視することができます。
図5。 L.に対応してカプセル化でvictoriae侵入蛇> GFP-dlのショウジョウバエのホスト。 蛇の遺伝子のエンハンサーは、血液細胞13で表されます。このエンハンサーは、遺伝子にGFP-背融合タンパク質の発現を駆動する場合、背側は、カプセルと凝集体を構成するいくつかのプラズマ細胞とlamellocytesにおけるGFPの緑色蛍光を介して検出されています。すべての画像はツァイスLSM共焦点顕微鏡を用いて得られた。L.の卵パネルB. EH試料中の試料の卵エクスプレスGFP-背の後端にvictoriae。BDの Lamellocytes（白矢印）。CD高倍率は、繊維状アクチン（F-アクチン、赤色）を可視化するためにローダミン標識ファロイジンで対比されているとヘキスト33258でL.のDNA（青）。Eカプセル化された卵を可視化するL.のvictoriae。Fメラニンカプセルvictoriae。GH L. victoriae infectionは、血液細胞（プラズマ細胞とlamellocyte）凝集を誘導する。
図6。スズメバチの感染に対する免疫応答。AとBのパネルの画像はツァイスAxioはスコープを使用して得られた。 CJは、ツァイスLSM共焦点顕微鏡を用いて得られたパネルの画像。透明なクチクラを通してメラニンカプセル化されたスズメバチの卵（矢印）を示すホストの幼虫はヘキスト33258で染色したB描写三齢幼虫のリンパ節腺はすべての葉と散在して心膜細胞の細胞を明らかにする。スケールバーは100μを表しています。CJは、すべてのサンプルはヘキスト33258（ラベル核）およびローダミンファロイジン（F-アクチンにラベルを付けるために）で対比染色した。コントロール（C）とL.からCD前方リンパ腺ローブはvictoriae感染（D）MSNF9-GFP動物。ラに特有の感染動物、MSNFエンハンサーの発現において、mellocytes 14は 、核のGFPレポーターで検出されています。感染動物から分離されたEのプラズマ細胞がGFPを発現しない。これらの動物は非常にいくつか持っている場合、任意のlamellocytes。L.からの弱い核のGFPの発現とFプラズマ細胞（GFP陰性、短い矢印）と新たに分化し、より大きいlamellocytes（長い矢印） L.の血体腔からvictoriae感染MSNF9-GFP幼虫。Gフリーと集計されたプラズマ細胞とlamellocytes victoriae感染DRS-GFPの幼虫。 DRS-GFPレポーターは、いくつかのプラズマ細胞（短い矢印）ではなく、lamellocytes（長い矢印）は、感染後に活性化されています。Hカプセル化され、L.からメラニンスズメバチの幼虫の発現boulardi感染MSNF9-GFPのホスト幼虫。多数のMSNF9-GFP陽性lamelloctyesは、スズメバチの幼虫（暗い構造、太い矢印）を取り囲み、強力な核GFP発現（長い矢印）を示す。このパンエルは、以前のPLoS One 15に発表した。感染していない（I）とL.から解剖IJ脂肪体の細胞がvictoriae感染（J）DRS-GFPの幼虫。 GFPは、感染した動物の脂肪体細胞の核と細胞質である。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
図7。 Spätzle寄生蜂感染後に発現。AJのサンプルは、DNAを可視化するためにヘキスト33258で対比染色した。すべての画像はツァイスLSM共焦点顕微鏡を用いて感染YWの幼虫から解剖AF前方のローブが得られた。サンプルは、一次抗体（AとB）を使用せずに、または抗SPZ抗体（赤、C、D、E、F）間接免疫染色のために処理し、細胞（緑色のラベルがF-アクチンにAlexaの小麦粉ファロイジンで対比。G、H、I、J）およびAlexa Fluor-ファロイジン（緑色;。感染YWの幼虫やステンド抗SPZ抗体を用いて（赤から解剖B、D、F）GJ前方のローブ。パネルH、J）EF高倍率それぞれがそれぞれCとD、GとHのサンプルの。IJ高倍率、内のサンプル。パネルは、AD、Gのスケールバーは、Hが50μmを表す。
図8。 L.の幼虫および蛹の段階heterotomaとL. boulardi。個々の段階が示されるように、幼虫または蛹のフライホストからポスト侵入を単離した。すべての画像はツァイスAxioはスコープを使用して得られた。 上段AF L. heterotomaステージ 、感染後1から6日。 下段AF後胚L. boulardiステージ 、感染後4〜12日。
図9。実験プロトコルのフローチャート。
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Discussion
ショウジョウバエの寄生蜂への関心が全ゲノムを解読するための分子技術は効率的かつ低コストになると急増している。しかし、彼らの非常によく研究されたホストへの相対的な、スズメバチの生物学の多くの魅惑的な側面が不明瞭なままである。これらは、宿主範囲、免疫抑制、過寄生、および動作に関連する問題が含まれています。このプレゼンテーションの焦点は、ハエの免疫組織に感染の効果を実証することであった。ここで示した解剖技術は、RNAレベル（in situハイブリダイゼーション ）で、またはマイクロアレイまたはPCR用核酸の抽出、またはタンパク質のウエスタン分析のために遺伝子発現の解析に使用することができます。フライ株の広大な様々な免疫細胞を操作し、ラベルを付けるために株式センターや個々の研究室から提供されています。フライ株の選択は、実験的な質問によって決定されます。これらの解剖技術はまた、免疫の分析のために使用することができます他のショウジョウバエ種の組織。
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Disclosures
利害の衝突が宣言されません。
Acknowledgments
我々はTrichopria drosophilae、トランスジェニックハエの系統の教授トニーIP、および抗Spätzle抗体の教授カール·橋本教授はトッドSchlenkeに感謝しています。我々は、このプレゼンテーションへの貢献のためにラボの現在と過去のメンバーに感謝します。 NIH（S06 GM08168、RISE 41399から009、及びG12-RR03060）、USDA（NRI / USDA CSREES 2006から03817と2009-35302-05277）およびPSC-CUNYから：この作品は、以下の補助金によって支えられている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
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