Summary
Parassitoide (parassita) vespe costituiscono una classe importante di nemici naturali di insetti tra cui
Protocol
Il protocollo per l'intero esperimento è diviso in quattro fasi (Fig. 9). (1) vespe colture sulla larve di mosca, (2) Impostazione infezioni e la preparazione degli animali per la dissezione, (3) isolamento e fissaggio ospite / parassita strutture; (4) Analisi dei tessuti del sistema immunitario.
1. Vespe colture sulla Larve Drosophila
Manutenzione delle culture vespa richiede un'attenta pianificazione. Rispetto al mosche in crescita, è abbastanza alta intensità di manodopera. Manteniamo le nostre colonie vespa in laboratorio su larve o pupe del ceppo yw di Drosophila a 24 ° C. Vespe coltura comporta mantenere una continua fonte di host in fase di destra e liquidare i "infetto" fiale di mosche che emergono prima le vespe fanno. Vespe aplodiploidi seguire il metodo di determinazione del sesso ed è quindi importante che le femmine si accoppiano prima che possano infettare i padroni di casa.
- Il giorno 1, aggiungere una goccia di fresco pre-lievito in pasta preparate (ottenuto mescolando 1 ml di acqua in circa 1 g di lievito secco attivo in una fiala di alimenti freschi fly La ricetta del cibo mosca non è critico;. si cresce mosche sul terreno corn-meal/sucrose/agar. Luogo giovane 50-60 (2-4 giorni di età) per adulti yw (o altro ceppo di tipo essenzialmente selvatico) vola a deporre le uova per 48 ore a 24 ° C.
- Il giorno 3, rimuovere le mosche dai flaconi. Posizionare un tappo buzz in fiala con una goccia di miele sul lato interno del tappo buzz. Il miele viene diluito 2:1 in acqua distillata.
- Utilizzo di CO 2, anestetizzare le vespe e ordinare 6-8 6-8 maschi e femmine che sono circa 2-3 giorni. Aggiungerli alla fiala contenente 0-48 ore i vecchi padroni di casa. Si noti che le vespe sono più sensibili alle emissioni di CO 2 rispetto mosche, e potrebbe essere necessario calibrare la loro esposizione al gas. Ricercatori Drosophila non si utilizzi uno standard di progettazione anestesia Drosophila stazione. Un buon punto di partenza per anestetizzare le vespe è impostare la pressione di CO 2a circa la metà di ciò che è necessario per le mosche anestetizzare.
- Sostituire il tappo ronzio (con miele) sul flacone. Posizionare delicatamente il flacone su un lato fino a quando le vespe svegliarsi.
- Posizionare questi flaconcini con larve di mosca e di vespe in un 24 ° C incubatore.
- Infezioni successo ritarderà pupariation leggermente. Gli host che hanno subito l'attacco di vespa, ma sono in grado di difendersi (o se non siano stati infettati), continuerà lo sviluppo seguendo il normale schema e le mosche adulte emergono da questi pupari ben prima delle vespe.
- A seconda della specie di vespa e la temperatura, vespe Eclose in 25-30 giorni.
- Rimuovere le mosche adulte dai flaconi in cui le vespe sono in via di sviluppo.
2. Impostazione e preparazione Infezioni animali infetti per Dissection
Prima di iniziare, un paio di vetro pulito o piastre di Petri in plastica, una pirofila dissezione con 9 depressioni, Kimwipes, acqua distillata (in una spruzzetta), Il 70% di etanolo (in una bottiglia a spruzzo), 1X PBS (in una bottiglia a spruzzo), vetrini da microscopio, e una piccola spatola pulita a portata di mano.
- Per impostare le infezioni, seguire i passaggi 1-5 sopra. Secondo l'esperimento, può essere necessario utilizzare host che sono più o meno allo stesso stadio di sviluppo. Per questo, egglays di 2-6 ore possono essere utilizzati per l'infezione.
- Per raccogliere le larve infette (per dissezioni dei tessuti del sistema immunitario o parassiti), rimuovere il contenuto delle fiale mosca in un bicchiere piccolo di plastica o capsula di Petri.
- Utilizzando un stereomicroscopio e pinza sottile (pinzette), scegliere con cura 6-10 larve, uno per uno e metterli in una depressione bene con PBS 1X, quindi trasferirli in acqua, etanolo al 70%, acqua, e 1X PBS, successivamente. Lo scopo di questi passi è quello di liberare gli animali del cibo mosca e pulire e sterilizzare la loro superficie. Il risciacquo in acqua diluisce l'etanolo e il risciacquo finale in PBS rimuove l'etanolo. Per la fase 3, non è meglio lasciare ilanimali in PBS per più di 10 minuti.
3. Isolamento e fissaggio ospite / parassita Strutture
Fondo
La ghiandola linfa larvale è un 7 piccolo organo ematopoietico. Al terzo stadio larvale, la ghiandola linfa contiene una grande coppia di lobi anteriore che fiancheggiano il vaso dorsale (Fig. 3A, 6B-C, 7A-D). I lobi frontali sono ulteriormente divisi in regioni specializzate di cellule con proprietà uniche 7. Progenitori di tre tipi di cellule, plasmatocytes lamellocytes, i cristalli e le cellule risiedono nei lobi frontali. Cellule pericardiche separare i lobi anteriori dei lobi posteriori più piccole. La ghiandola linfa Drosophila è un modello per ematopoiesi insetti e mammiferi 8,9.
Di grasso corporeo è funzionalmente simile al fegato dei mammiferi. La risposta umorale scatta nel microbica grasso seguente corpo o infezione vespa 1,4,10. ComeDi conseguenza, una combinazione unica di geni peptide antimicrobico e vengono attivati i peptidi sono secreti nel emolinfa 1. Il corpo grasso è anche il tessuto primario per la produzione di glicogeno e di trigliceridi e 11 di memoria. Il corpo larvale grasso occupa il volume sostanziale del hemocoel e, quindi diversamente dalla ghiandola linfa, è facile individuare. Noi ora dimostrare come sezionare la ghiandola linfatica e il corpo di grasso dalla terza larve instar.
Prima di iniziare
Hai bisogno di pinza sottile (pinzette) e etanolo puliti vetrini da microscopio.
Larvale linfa dissezione della ghiandola
- Utilizzando una pinza sottile, selezionare una larva vagante terzo stadio tenuti in 1X PBS.
- Posizionare la larva su un vetrino da microscopio.
- Utilizzando pinze, posizionare l'animale con il lato ventrale alto.
- Utilizzando due coppie di pinze, tenere l'animale ai lati della estremità posteriore (frecce 1, Fig. 3A) e gtemente tirare la cuticola di introdurre una piccola lacerazione superficiale nella cuticola.
- L'emolinfa contenente emociti, intestino, e il corpo di grasso comincerà a uscire dalla cavità del corpo. L'emolinfa può essere assunto con un ul 10 "pipetteman" per fare strisci, se necessario.
- Immissione entrambi pinza sul lato destro della animale sotto i ganci bocca (frecce 2, Fig. 3A), delicatamente strappare la cuticola.
- Spostare entrambi pinza sul lato sinistro della animale sotto i ganci bocca (frecce 2, Fig. 3A) e accuratamente fare un altro piccolo strappo.
- Mentre si tiene la bocca ganci dell'animale, tirare delicatamente le cuticole verso l'estremità posteriore dell'animale (come se peeling indietro).
- Come la cuticola è tirato indietro, il cervello, grasso corporeo, i dischi immaginali, ghiandole salivari, e proventricolo sarà esposto. La cuticola è ora distaccato alla fine posteriore, ma avrà ancora il vaso dorsale con la ghiandola linfa collegato ad esso. </ Li>
- Tagliare il proventricolo e allontanarlo dalla zona ghiandole linfatiche. La ghiandola linfatica sarà sotto il cervello, anche se non sarai in grado di vederlo.
- Con attenzione stuzzicare via il grasso corporeo, intestino, ghiandole salivari, e altre strutture che potrebbero essere seduti sulla ghiandola. Fare attenzione a non staccare la ghiandola linfa dalla ghiandola anello e il vaso dorsale situata posteriormente al cervello. La ghiandola linfa verrà posizionata piatta contro il vetrino da microscopio.
- Rimuovere con cautela tutti i tessuti aggiuntivi lontano dalla ghiandola linfatica fino a tutta la ghiandola si sviluppa dai lobi anteriori al set finale di cellule pericardiche.
Nota: Una ghiandola linfa correttamente sezionato avrà una coppia di lobi anteriore e due serie di lobi posteriori lungo il vaso dorsale (Fig. 6B). I lobi possono essere danneggiati facilmente o può cadere fuori dal vaso dorsale. I campioni dovrebbero pertanto essere maneggiate con molta cura. La ghiandola anche hcome la tendenza a incenerire o contratto. Delicatamente raddrizzare l'organo alla sua estremità posteriore permette di tutte le parti e le cellule da presentare bene. Ciò è particolarmente necessario per i protocolli immunocolorazione.
Fay dissezione del corpo
- Sul palco dissezione del microscopio Zeiss dissezione 1000 (qualsiasi stereo dissezione microscopio può essere utilizzato), posizionare una scatola luminosa che permette alla luce incidente deve essere trasmessa attraverso il campione. Posizionare un terzo stadio di larva Fase 2 su un vetrino da microscopio in 200 microlitri di PBS 1X. Inclinare la sorgente di luce dal campione in modo che l'organismo appare trasparente e quindi è facile visualizzare i suoi organi interni.
- Utilizzando pinze, la posizione dell'animale in modo che l'estremità anteriore è lontano da voi.
- Utilizzando pinze, tenere la cuticola della larva sul lato sinistro dei suoi ganci bocca (freccia 1, Fig. 3B). Utilizzando le pinze altri, delicatamente strappare la cuticola fino alla estremità posteriore (arrowhead 2, figura 3B). Non strappare la cuticola lontano dal corpo all'estremità posteriore.
- Molto delicatamente iniziare a rimuovere l'intestino da un lato.
- Rimuovere delicatamente il cervello, i dischi immaginali, e la ghiandola anello con la ghiandola linfatica che attraversa il vaso dorsale.
- Non rimuovere le ghiandole salivari poiché non vi è grasso corporeo aderire a queste ghiandole.
- Rimuovere delicatamente le cuticole e lasciare il corpo di grasso sulla diapositiva in 1X PBS.
Nota 1: Il corpo grasso ha un solo strato di cellule ed è quindi importante disporre di tutte le celle appiattita nel piano stesso sul vetrino. Le cellule sono endopolyploid e facili da visualizzare. A ben sezionato campione di grasso corporeo dovrebbe mantenere i contatti cellule normali, e dovrebbe avere minimi globuli di grasso in tutto il campione sezionato (Fig. 6I, J).
Nota 2: Se le uova di vespe rimangono inalterati dal sistema immunitario dell'ospite, saranno initiate lo sviluppo quasi immediatamente. I primi stadi di sviluppo del parassita (dalla larva host) sono facilmente accessibili dal hemocoel sezionato (Fig. 8). Uova di parassiti o larve o aderiscono al corpo grasso o altri organi, o semplicemente scivolare sul vetrino durante la dissezione.
4. Analisi dei tessuti del sistema immunitario
- Ghiandole linfatiche aria a secco per 5-10 minuti e rimuovere 1X PBS dalla diapositiva del grasso corporeo prima di fissare per 5-10 minuti con il 4% paraformaldeide preparato in PBS. Ogni diapositiva può avere diverse ghiandole linfatiche sezionati per la colorazione. Spostare i vetrini con i campioni fissi in una camera di casa umidificata per le fasi successive. Questa camera si prepara mettendo due pezzi di carta piegati, asciugamani umidi sul fondo di una scatola vuota punta della micropipetta in plastica. Uno o più vetrini con campioni può essere posizionato sulla parte superiore del divisore utilizzato per tenere le punte.
- Come tale, l'analisi dei tessuti immunitarie avviene seguendo metodi standard checombinano in marcatura delle cellule in vivo e 4 immunoistochimica indiretta.
5. Risultati rappresentativi
- Wasp infezione attiva l'espressione del reporter percorso Drosomycin Toll-GFP (Fig. 6G, J). In questo esperimento, l'effetto di vespa-infestazione sull'espressione del gene è visualizzato in vivo usando un GFP-reporter legato al promotore Drs 12. In animali di controllo non infettate, l'espressione di GFP non viene rilevato. Il segnale GFP è chiaramente rilevata nel citoplasma e nucleo delle cellule del grasso corporeo, sezionato animali infettati da L. victoriae. Per ottenere i migliori risultati, il rapporto di vespe: padroni di casa dovrebbe essere 1:10. L'infezione dovrebbe durare per almeno 2 ore. Infestazione Post, i dottori-GFP intensifica segnale e molte cellule di grasso corporeo sono GFP-positive anche fino a 72 1,4 ore.
- Wasp infezione induce la differenziazione del lamellocytes in lymph ghiandola (Fig. 6D). Lamellocytes circondare e bloccare lo sviluppo vespa (Fig. 6H). Le ghiandole linfatiche sono sezionati per visualizzare le modifiche cellulari indotte nei lobi anteriori dopo la L. victoriae infezione. Recentemente differenziati lamellocytes sono presenti alla periferia dei lobi sezionati; lamellocytes sono contrassegnati con un transgene GFP che è guidato dal deforme enhancer (MSNF9-GFP). Tutte le cellule sono visualizzate con l'actina filamentosa con rodamina marcato phalloidin. Si noti che l'integrità dei lobi anteriore è interrotto in queste ghiandole come la membrana basale che circonda normalmente il lobo continuo (Fig. 6C), è ora discontinuo (Fig. 6D). Dalle stesse dissezioni, lamellocytes nella emolinfa può anche essere visualizzato in strisci (Fig. 6G), alcuni dei quali sono associati alla struttura capsula formata per bloccare parassita sviluppo (Fig. 6H).
- Spätzle proteina è espressa nella maggior parte delle cellule della ghiandola linfa larvale (Fig. 7C, D). Per rilevare SPz nelle ghiandole linfatiche dissezionati, abbiamo seguito un protocollo standard per la colorazione delle cellule della ghiandola linfa con policlonali anti-SPZ anticorpi 4. In vivo, SPz aumento dei livelli nelle cellule delle ghiandole linfatiche dopo l'infezione vespa (cfr. Fig. pannelli. 7C, E con il 7G, I, e 7D pannelli, F con 7H, J).
- Fasi precoci e tardivi di sviluppo delle larve di vespa host e pupe (Fig. 8). Per esaminare le fasi di sviluppo di vespe, larve infette vengono sezionati in vari momenti dopo la deposizione delle uova. Qui vi mostriamo alcuni esempi di queste fasi da Leptopilina spp. Dal tipo selvatico infetto D. melanogaster ospita.
Figura 1. Diverse specie di vespe e deposizione di uova di vespa. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando uno stereomicroscopio Leica. Una vespa Trichopria drosophilae femminile oviposits uovo in una D. melanogaster pupa. ingrandimento B di deposizione delle uova di Trichopria drosophilae ad un host pupa. punti C melanized indicano la guarigione della ferita al sito di deposizione delle uova. D L. Boulardi maschile. E G. xanthopoda femminile. F L. victoriae femminile. L. G heterotoma maschio (a sinistra) e femminile.
Figura 2. Cicli di vita che mostrano la mosca / vespa corsa agli armamenti. Risultati deposizione delle uova in uno dei due risultati. Sia le reazioni immunitarie riescono a bloccare lo sviluppo della vespa (a sinistra), o la vespa ostacola immunitario dell'ospite RESPONs e riesce (a destra). Modificato da Melk e Govind, 1999 18.
Figura 3. Terzo stadio larve che mostra gli organi di interesse prima dissezione. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando uno stereomicroscopio Leica. A amb> larva GFP con GFP (verde) fluorescenza (freccia) in singole cellule della ghiandola linfa indica la posizione generale della ghiandola linfa in un animale intatto. La larva è stato ripreso con ottica di campo fluorescenza e luminoso. Frecce puntare a posizioni importanti per il protocollo di dissezione linfonodale ghiandola descritto nel testo. B Cg> larva GFP GFP con l'espressione del grasso corporeo per indicare la posizione dell'organo in un anim intattaal. Frecce indicano posizioni importanti per il protocollo grasso dissezione corpo descritto nel testo.
Figura 4. Immuno-genetica circuito di risposta immunitaria contro le componenti principali parassitoidi attacco. Del percorso Toll sono mostrati. Spätzle (ZPS) si attiva l'enzima proteasi di elaborazione Spätzle, SPE. Activated SPz funge da ligando per Toll. Segnalazione intracellulare porta alla attivazione di NF-KB fattori di trascrizione, dorsale e Dif. Cactus serve come inibitore IkB del percorso. Attivazione di Drosomycin, uno canonica percorso Toll gene bersaglio, può essere monitorata utilizzando ceppi mosca transgenici con il reporter GFP (vedi fig. 6I, J).
Figura 5. L'incapsulamento in risposta a L. victoriae infestazione inSerpent> GFP-dl host Drosophila. Un potenziatore nel gene Serpent è espresso in cellule del sangue 13. Quando questo enhancer guida l'espressione della GFP-Dorsal proteina di fusione in un transgene, Dorsal viene rilevata tramite il fluorescenza verde di GFP in alcuni plasmatocytes e lamellocytes che compongono le capsule e aggregati. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM. Un Uovo di L. ingrandimenti victoriae. Lamellocytes BD (frecce bianche) alla fine posteriore della express uovo GFP-dorsale. CD più elevate del campione nel pannello B. EH I campioni vengono contrastate con rodamina marcato phalloidin per visualizzare actina filamentosa (F-actina, rosso) e con Hoechst 33258 per visualizzare il DNA (blu). E Encapsulated uovo di L. victoriae. F capsule melanized di L. victoriae. GH L. victoriae inferioritàZIONI induce cellule del sangue (plasmatocyte lamellocyte e) l'aggregazione.
Figura 6. Risposte immunitarie contro l'infezione vespa. Immagini nei pannelli A e B sono state ottenute utilizzando un ambito Zeiss Axio. Immagini in CJ pannelli sono stati ottenuti utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM. Una larva Host mostrando melanized uovo incapsulato vespa (punta di freccia) attraverso la cuticola trasparente. B rappresentante terzo stadio larvale ghiandole linfatiche colorate con Hoechst 33258 rivela cellule di tutti i lobi e intervallati cellule pericardiche. Barra della scala rappresenta 100 μ. CJ Tutti i campioni sono contrastate con Hoechst 33258 (per nuclei etichetta) e rodamina phalloidin (per etichettare F-actina). CD anteriori lobi delle ghiandole linfatiche dal controllo (C) e L. victoriae-infetti (D) MSNF9-GFP animali. Negli animali infetti, MSNF espressione enhancer, specifici per lamellocytes 14, viene rilevata con un reporter GFP nucleare. Plasmatocytes E isolati da animali infetti non esprimono GFP. Questi animali hanno ben poche o nessuna lamellocytes. F Plasmatocytes (GFP-negativi, freccia corta) e neo-differenziati, lamellocytes più grandi (frecce lunghe) con debole espressione di GFP nucleare da L. victoriae-infetto MSNF9 GFP-larva. plasmatocytes G gratuite e aggregati e lamellocytes dal hemocoel di una L. victoriae-infetto Drs-GFP larva. L'espressione della DRS-GFP giornalista è attivata in alcuni plasmatocytes (freccia corta), ma non in lamellocytes (frecce lunghe) post-infezione. H incapsulati e larva di vespa melanized dalla L. Boulardi-infetti MSNF9-GFP larva ospite. Numerosi MSNF9-GFP-positive lamelloctyes circondano la larva di vespa (struttura buio; freccia di spessore) e mostrano una forte espressione nucleare GFP (frecce lunghe). Questo panel precedentemente pubblicato su PLoS One 15. IJ cellule del corpo grasso sezionato da non infetto (I) e L. victoriae-infetto (J) DRS-GFP larva. GFP è nucleare e citoplasmatica nelle cellule di grasso corporeo degli animali infetti. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 7. Espressione Spätzle dopo l'infezione vespa parassitoide. Campioni AJ sono state contrastate con Hoechst 33258 per visualizzare il DNA. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un microscopio confocale Zeiss LSM. Lobi AF anteriori sezionati da larve yw infetto. I campioni sono stati trattati per immunostaining indiretti senza anticorpo primario (A e B) o con anticorpi anti-SPz (rosso, C, D, E, F) e di contrasto con Alexa Farina-phalloidin all'etichetta F-actina in cellule (verde;. B, D, F) GJ lobi anteriori sezionati da larve yw infetto e colorate con anticorpi anti-SPz (rosso, G, H, I, J) e Alexa Fluor-phalloidin (verde. Pannelli H, J) EF alti ingrandimenti di campioni in C e D, rispettivamente. ingrandimenti IJ superiori dei campioni in G e H, rispettivamente. Bar Scala in AD pannelli, G, H rappresentano 50 micron.
Figura 8. Stadi larvali e pupe della L. heterotoma e L. Boulardi. singole fasi sono stati isolati da larva o pupa fly postale infestazione padroni di casa, come indicato. Tutte le immagini sono state ottenute utilizzando un ambito Zeiss Axio. Top fila AF L. heterotoma fasi, 1-6 giorni dopo l'infezione. fila inferiore AF postembrionale L. Boulardi fasi, da 4 a 12 giorni dopo l'infezione.
Figura 9. Diagramma di flusso del protocollo sperimentale.
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Discussion
L'interesse per le vespe parassite di Drosophila è in aumento come tecniche molecolari per decodificare genomi interi diventare efficiente e conveniente. Tuttavia, rispetto ai loro eccezionalmente ben studiati padroni di casa, molti aspetti affascinanti della biologia vespa restano oscuri. Questi includono le questioni relative ad ospitare gamma, soppressione immunitaria, superparasitism, e il comportamento. L'obiettivo di questa presentazione è stato quello di dimostrare gli effetti di contagio sui tessuti del sistema immunitario della mosca. Le tecniche di dissezione dimostrato qui può essere utilizzato per l'analisi di espressione genica a livello di RNA (ibridazione in situ), o per l'estrazione di acido nucleico per microarray o PCR, o per analisi di proteine occidentali. Una vasta gamma di ceppi di mosca sono disponibili presso i centri fotografici e laboratori di ricerca individuali per manipolare ed etichettare le cellule immunitarie. La scelta dei ceppi mosca è dettata dalle domande sperimentali. Queste tecniche di dissezione può anche essere utilizzato per l'analisi di immunetessuti di altre specie di Drosophila.
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Disclosures
Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.
Acknowledgments
Siamo grati al professor Todd Schlenke per Trichopria drosophilae, Prof. Tony Ip per i ceppi transgenici mosca, e il Prof. Carl Hashimoto per gli anticorpi anti-Spätzle. Ringraziamo i membri presenti e passati del laboratorio per il loro contributo a questa presentazione. Questo lavoro è stato supportato da i seguenti aiuti: dal NIH (S06 GM08168, RISE 41399-009 e G12-RR03060), USDA (NRI / USDA CSREES 2006-03817 e 2009-35302-05277) e PSC-CUNY.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | Fisher Scientific | S80245-3 | Active Dry |
| Fly Food | Home made | Corn meal, sugar | Standard |
| Honey | Dutch Gold | From the store | Clover |
| Vials | Fisher Scientific | AS514 | |
| Cotton plug/Foam stopper | Fisher Scientific | 14-127-40A | |
| Spatula | Fisher Scientific | 21-401-15 | |
| Pyrex dissecting dish | Fisher Scientific | 50-930-382 | 9-well |
| Microscope slides pre-cleaned | Fisher Scientific | 7101 | 25.4 mm x 76.2 mm |
| Glass coverslips | Pearl | D12544 | 22 x 50 |
| Glass coverslips | Pearl | G12544 | 22 x 60 |
| Pasteur Pipette | J H Berge | 71-5200-05 | |
| 100 mm Tweezers | Sigma-Aldrich | T-4662 | Style # 5 |
| Wash Bottle | Fisher Scientific | 03-409-22A | Fisherbrand |
| Kim Wipess | Fisher Scientific | 34155 | Kimberly Clark |
| Paper Towel | Fisher Scientific | Fisher X-101-C | 1/8 x 13 1/8 in. |
| Leica stereomicroscope | Empire Imaging Systems, INC. | 10446208 | MZFLIII |
| Zeiss Stereomicroscope | Carl Zeiss, Inc. | 000000-1006-126 | "Stemi" 1000 or 2000-C |
| Light Source -LED Gooseneck illuminator | Fisher Scientific | 12563501 | |
| Stage | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Zeiss Laser 510 Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 815 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Salt Solution 1X | Fisher Scientific | MT-21-030-CM Mediatech | |
| Ethanol | Fisher Scientific | 64-17-5 | 99.5 % |
| Formaldehyde (37% w/w) | Fisher Scientific | F79-1 | |
| H–chst 33258 | Molecular Probes, Life Technologies | H-1398 | 0.2 μg/ml Excitation 352 nm; Emission 461 nm |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | R415 | 200 units/ml (6.6 μM) Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Alexa Fluor 488 phalloidin | Molecular Probes, Life Technologies | A22289 | Excitation 495 nm; Emission 518 nm 300 units/ml |
| CO2 tank | TW Smith | ||
| Anti-Spz antibody | Gift Dr. C. Hashimoto (Yale) | ||
| Secondary antibody TRITC-conjugated donkey anti-rabbit, concentration 1:50. | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Detected at Excitation 546 nm; Emission 565 nm |
| Antifade | MP Biomedicals | ICN10274790 | 0.08 mg of N-propyl gallate in 20 ml of 50% glycerol in 1X PBS |
| Wasp Strains | Fly Strains | ||
| L. victoriae16 | y w | ||
| L. boulardi 171 | UAS-GFP-Dorsal17 | ||
| L. heterotoma2 | SerpentHemoGal413 | ||
| L. heterotoma 141 | MSNF9-moCherry14 | ||
| Trichopria drosophilae | MSNF-GFP15 | ||
| G. xanthopoda18 | y w Serpent-Gal4 UAS GFP-Dorsal/Basc4 | ||
| y w ; Drosomycin-GFP/CyO y+12 | |||
References
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